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【摘要】 目的 研究液氮浅低温冷冻对皮肤色素及黑色素的影响。方法 用液氮浅低温冷冻机直接接触法和棉签法冷冻。结果 显示冷冻后家兔毛被黑而粗，与对照组不同，后者为细、软、色淡的毳毛样毛被，并且所有实验区伴有色素沉着，组织学显示表皮黑色素颗粒和黑色素细胞数目显著增多（P<0.001）。结论 浅低温冷冻可增加黑色素细胞数目和促进黑色素的合成，此为临床上用该法治疗斑秃和白癜风提供了理论依据。
关键词 液氮浅低温冷冻 黑色素 黑色素细胞
我们用液氮浅低温冷冻疗法治疗斑秃取得了满意的疗效 ［1］ 。其有效率及痊愈率高、见效快、无副作用、方法简便等优点，优于斑秃的一般疗法，而且用该法治疗后的新生毛发为粗而黑的正常毛发，而非其它疗法后长出的细、软、色淡或白色的毳毛样发。我们进一步通过实验研究，证实了比与浅低温冷冻刺激了黑色素细胞，使之数目增加和功能有增强有关。
1 材料与方法
1.1 动物 体重1.5～2kg的健康成年黑色家兔24只，雌雄不限。
1.2 方法 实验组以接触法和棉签法随机分为两组进行了冷冻，每组各10只，每只兔臀部剪毛后不冷冻作自身对照，另设对照组4只，背部剪毛后不予冷冻。
1.2.1 接触法冷冻组 剪去兔背部毛被，以2%龙胆紫标记出直径2cm大小的实验区3处，用江苏泰兴电工器械厂生产的液氮冷冻治疗机接以直径1cm大小的冷冻头，以直接接触法冷冻已标记好的实验区，从冷冻头接触兔皮开始计时，冷冻15s，冻融2次为1个周期。1.2.2 棉签法冷冻组 同样剪毛后以棉签蘸液氮涂擦实验区，使局部结一层簿霜（约1s），自然融化后再涂擦2次为一周期。对照组及自身对照区均剪毛后不予冷冻。
1.3 观察项目 （1）于实验组冷冻后每日肉眼观察各组局部皮肤及毛被色泽变化。（2）组织学检查:于冷冻后2h、24h、48h、7d、14d分别切除实验组与对照组皮肤，以10%甲醛固定、石蜡包埋切片，HE染色作光镜检查。随机观察每组几个视野的表皮黑色素颗粒的密度并计数黑色素细胞数目，做统计学处理。
2 结果
2.1 局部皮肤及毛被色素变化
2.1.1 接触法组 冷冻14d后，有2只兔在冷冻边缘区长出数根粗而黑的毛，长约0.2cm，28d后，各冷冻区边缘均布满一圈又粗又黑的毛，长约0.4cm。50d左右冷冻区中央开始长出灰白色毛。80d左右冷冻区毛长至1cm以上，局部皮肤均出现深黑色色素沉着，冷冻区中央灰白色毛边变为黑色，114d后皮肤色素沉着消退，毛被长至正常长度。
2.1.2 棉签法组 冷冻后18d，一只兔在冷冻区散在地长出0.3cm之粗黑毛，23d左右，所有冷冻区均弥漫性地长出粗黑毛被，长约0.4cm，28d左右，局部皮肤出现色素沉着，49d以后，皮肤色素沉着渐消退，90d左右实验区毛被长度超过正常毛被长度。对照组及自身对照区:在实验组冷冻107d和114d左右始见有少量细软灰黑色兔毛长出，长度0.2～0.3cm，速度缓慢，共有3处对照区皮肤出现小片状色素沉着。
2.2 组织学改变 冷冻2h后，皮肤水肿，真皮浅层毛细血管扩张、充血，并有嗜酸性细胞、淋巴细胞及少量浆细胞浸润，24h达高峰，48h后上述反应减轻。1周后组织水肿及细胞浸润消退，表皮及毛囊上皮呈增生状态，基底层色素颗粒及黑色素细胞数目增多，真皮毛细血管数目增多。皮肤色素沉着区活检:基底层及部分棘层下部色素颗粒呈弥漫性分布，黑色素细胞数目显著增多，遍及整个色素沉着区，与对照组形成鲜明对比P<0.001）。黑色素细胞形态与对照组差异无显著性。
3 讨论
黑色素细胞对冷冻较为敏感，冷冻-30℃以下，黑色素细胞即被破坏，故在人类，深低温冷冻后形成的色素减退斑很少有色素恢复现象。Burge等研究了豚鼠皮肤深度冷冻后的色素变化和黑色素细胞的分布 ［2］ ，发现冷冻1个月后，所有冷冻区中央出现了色素减退，周围伴有一圈色素沉着区，光镜下见色素减退区缺乏黑色素细胞，而色素沉着区，黑色素细胞数目显著增加（P<0.001）。冷冻2个月后，色素渐从冷冻边缘的色素沉着区扩散至中央的色素减退区。3个月后，所有色素减退区出现了弥漫性色素沉着，光镜下见黑色素细胞遍及整个弥漫性色素沉着区。电镜下见这些黑色素细胞与邻近正常皮肤的黑素细胞之超微结构无明显区别。因而笔者认为:轻微的表皮损伤可增加黑色素细胞之合成和使以前多已阴性的黑色素细胞合成黑色素，而迁移至冷冻损害边缘的黑色素细胞能耐受次致死冷冻剂量而合成大量的黑色素。我们的实验结果与上述报道类似。不管是临床上用浅低温冷冻疗法治疗斑秃时 ［1］ ，还是动物实验中，其新生毛发均粗而黑，而非同其它疗法后长出的细软、色淡或白色的毳毛样发（本组接触法组因冷冻剂量大于棉签法，故中央区新生毛发细软、色淡以后 才变为正常色泽）。同时，实验组在毛被生长过程 中，皮肤也伴随着出现色素沉着，持续20～30d天方消退，组织学显示冷冻组色素颗粒及黑色素细胞数目显著增多（P<0.001）。
Tosti等发现，斑秃的毛囊受累、黑色素细胞也从毛球消失 ［3］ ，故开始长出的毛发往往是白色或比原色泽为淡，这说明斑秃的黑色素细胞也是受损的。本试验进一步证明:浅低温冷冻能刺激黑色素细胞使之数目增加和功能增强，因而合成大量的黑色素。此为临床上用该法治疗斑秃及白癜风提供了理论依据。
参考文献
1 Yang Lei.Effect of superficial Hypothermic cryotherapy with Liquid nitroˉgen on Alopecia areata:Arch Dermatol，1991，127（12）:1851.
2 Burge SM.Pigment change and melanocyte distribution in guinea pig skin after cutaneous freeze injury:J.Invest Dermatol，1987，88（2）:136.
3 Tosti A.Ocular obnormalities occurring with alopecia areata:Dermatologiˉca，1985，170（2）:69.
（收稿日期:2004-06-19）
作者单位:1256603山东滨州医学院附院皮肤科
2上海市芦湾区医院皮肤科
3山东滨州医学院生物教研室
（编辑维 兰）