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【摘要】 目的 观察阿霉素（Doxorubicin，DXR）诱导HSP72对大鼠肝脏长时间冷保存的保护作用。方法 实验组SD大鼠按1mg/kg DXR给药，对照组给予生理盐水，48h后用4℃林格液和UW液行肝脏原位冷灌注，肝脏UW液4℃保存24、36、48h，检测保存液谷草转氨酶（ALT）、谷丙转氨酶（AST）、乳酸脱氢酶（LDH）、透明质酸（HA）平，并行肝组织HE染色、HSP72免疫组化和电镜观察。结果 大鼠肝脏UW液保存243648h，DXR组保存液AST、ALT、HA浓度显著低于对照组（P<0.05），而LDH浓度两组差异无显著性（P>0.05）;组织病理及电镜结果显示，DXR组肝组织形态基本正常，肝细胞及肝窦内皮细胞表达HSP72，对照组肝组织损伤严重，无HSP72表达。结论 阿霉素预处理可使肝脏冷保存时间延长并保持其活性;HSP72的表达可以保护肝脏抵御长时间冷保存造成的损伤。
关键词 阿霉素 HSP72 大鼠肝脏 低温保存
protective effect of HSP72induced by pretreatment of doxorubicin for long term preservation of rat liver
Chen Hao，Deng Xiaxing，Yang Weiping，et al.
Reijin Hospital of Shanghai2nd Medical University，Shanghai200025.
【Abstract】 Objective To observe the protective effect of HSP72induced by pretreatment of Doxorubicin（DXR）for long-term cold preservation of the rat liver.Methods The Sprague（Dawley rats were administered intravenously by DXR at a dose of1mg/kg body weight in DXR group and by saline in control group.After48hours，the rat liver was perfused by using cold Linger’s and University of Wisconsin（UW）solutions and then was preserved in UW solution at4℃for24，36and48hours.AST，ALT，LDH and hyaluronic acid in preservative solution was determined;routine HE，immunohistochemical staining for HSP72and electron microscope examination in hepatic tissue were performed.Reˉsults After24，36and48hours，AST，ALT and hyaluronic acid in preserved solution was significantly higher in conˉtrol group than those in DXR group（P<0.05），and while LDH level was not significantly different between two groups（P>0.05）.Hepatic tissues in DXR group were normally morphological and significantly injured in control group.HSP72was expressed in hepatocytes and sinusoidal endothelial cells in DXR group but not in control group.Conclusion Pretreatment of DXR may extend the term of rat liver cold preservation and keep liver alive.The expression of HSP72in liver can prevent hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from long term cold preservation injury.Key words doxorubicin HSP72 rat liver cold preservation
自从Belzer于1988年发明了UW液以后，器官保存时间大大延长了，但是低温保存损伤仍然是器官移植失败的一个重要原因 ［1］。据报道，在肝、肾、肺等器官中，诱导热休克反应（HSR）表达热休克蛋白可抵御冷保存-再灌注损伤 ［2，3］ 。Kume ［4］ 报道利用阿霉素（Doxorubicin，DXR）诱导热休克反应（HSR）抵御肝脏热缺血-再灌注损伤。本研究旨在观察阿霉素诱导HSR对肝脏长时间冷保存的保护作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物 清洁级雄性SD大鼠36只，体重200～300g，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司。根据大学动物保护政策，所有大鼠在饲养室用标准动物饲料和水喂养，饲养室温度为恒温（18～25℃），12h光照和12h黑夜交替（7A.M.-7P.M.）。实验前禁食12h，自由饮水。
1.2 实验设计 将36只大鼠随机分成阿霉素（DXR）组和对照组，DXR组手术前48h按1mg/kg ［5］ 体重静脉注射DXR，对照组则注射生理盐水1ml。肝脏原位冷灌注后分别保存24、36、48h。
1.3 肝脏原位冷灌注及冷保存 大鼠肝脏冷灌注采用Kamada和Calne的技术。乙醚吸入麻醉，经静脉注射肝素生理盐水2ml（250U/ml）。正中切口进腹，14号穿刺导管插入腹主动脉，10ml4℃林格液经腹主动脉灌洗，同时切断肝脏上、下下腔静脉作为流出道，然后经门静脉依次推注4℃林格液5ml和4℃UW液（Dupan公司）10ml。切取肝脏置40ml4℃UW液中保存。
1.4监测指标
1.4.1 保存液谷草转氨酶（ALT）、谷丙转氨酶（AST）、乳酸脱氢酶（LDH）检测 取保存24、36、48h各组保存液，用标准生化自动分析仪测定AST、ALT、LDH（Backman DU640）。
1.4.2 保存液透明质酸（HA）检测 取保存24、36、48h各组保存液，测定HA。HA测定采用HA放免试剂盒（上海海研医学生物技术中心）。
1.4.3 病理学检查 取保存24、36、48h各组肝脏组织保存于10%福尔马林溶液，石蜡包埋。组织切片（厚4μm）做常规HE染色。HSP72免疫组化用小鼠抗HSP72单克隆抗体（Oncogene公司），按1:100稀释，兔抗小鼠IgG（Dako公司）作为二抗。切片和辣 根过氧化物酶结合的链霉生物素复合物共同孵育。然后DAB（DAKO Envision TM ，Dako公司）作为底物，苏木精复染。所有
切片用光学显微镜观察（Olympus BX51）。
1.4.4 肝组织透射电镜检查 将肝脏标本切成1～2mm 3 置入4℃2%戊二醛中固定。PBS缓冲液漂洗后，置入1%锇酸中固定。经逐级乙醇脱水、环氧乙烷置换、铀铅染色后，透射电镜观察（Hitachi500）。
1.5 统计学分析 数据均用均数±标准差（ˉx±s）表示，两组均数间的比较用团体t检验，P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 肝脏保存24、36、48h保存液AST、ALT、LDH水平 对照组肝脏UW液保存24、36、48h保存液AST、ALT浓度显著高于DXR组（P<0.05），而LDH浓度两组差异无显著性（P>0.05）（表1）。 表1 肝脏UW液保存两组ALT、AST、LDH比较（略）
2.2 肝脏保存24、36、48h保存液透明质酸（HA）水平 对照组肝脏UW液保存24、36、48h保存液HA浓度显著高于DXR组（P<0.05）（表2）。 表2 肝脏UW液保存两组HA比较（略）
2.3 肝脏组织学及HSP72免疫组化 肝脏在UW 液中保存24～48h，对照组肝细胞有肿胀、气球样变、空泡样变，部分肝细胞有自溶性改变，大部分肝窦内皮细胞（SEC）有肿胀、变圆、脱离基底膜，肝窦腔变窄。DXR组肝实质细胞正常，少量SEC肿胀、变圆，少量脱离基底膜。肝脏在UW液中保存24～48h，DXR组肝细胞和SEC均有HSP72表达，而对照组无表达。
2.4 透射电镜 肝脏在UW液中保存24～48h，对照组肝细胞有线粒体肿胀、出现脂肪小滴，部分SEC出现变圆、脱离基底膜、细胞核固缩。DXR组肝细胞形态基本正常，少量SEC出现细胞肿胀、变圆脱离基底膜。
3 讨论
DXR是一种常用抗癌药物，同时可诱发热休克反应 ［6，7］ 。DXR在肝脏内积聚、代谢，其代谢产物是半醌自由基的底物，后者可触发细胞氧化应激反应，诱导SP72表达。体外试验结果提示，Hela细胞、心肌细胞在DXR诱导下可表达HSP72 ［8，9］ 。本研究采用DXR诱导热休克反应的特性观察了其对大鼠肝脏长时间冷保存的保护作用。应用UW液使器官冷保存时间达到24h。UW液可减轻细胞肿胀、减少ROIs的产生、防止细胞摄入钠和钙并提供ATP合成的底物 ［2］ 。但是在低温保存过程中，随着保存时间的延长，细胞仍受到不同程度的损伤。在肝脏冷保存期间，肝细胞和SEC均受损，但后者损伤更严重 ［10］ 。肝脏热缺血时，肝细胞比SEC更脆弱。但是肝脏在冷保存期间，肝细胞则很少受损。然而随着冷保存时间的延长，肝细胞出现不同程度的损伤。冷保存对肝细胞造成损伤的主要原因是无氧酵解引起的细胞内酸中毒以及蛋白质合成障碍、糖原和ATP的耗尽，使肝细胞对以后的复温缺血、再灌注损伤的防御能力下降。冷保存期间，在形态学上肝细胞出现肿胀、泡球样变性。虽然短时间冷保存对肝细胞形态没有显著影响，但是其功能已受到损伤 ［11］ 。
本研究结果显示，大鼠肝脏UW液冷保存24～48h，形态学上各时间段DXR组肝细胞基本保持正常，对照组保存36～48h，肝细胞出现明显的损伤。在肝细胞功能上，各时间段DXR组保存液中ALT、AST显著较对照组低（P<0.05），说明DXR预处理对肝细胞有显著的保护作用。在肝脏的冷保存期间，SEC对低温损伤最敏感，SEC的损伤主要是由血管生成因子和蛋白酶直接破坏与SEC连接的结缔组织基质中的纤维连接素，后者是SEC细胞胞膜上整和素相连的胶原蛋白 ［12］ 。在形态学上，SEC可变圆，脱离基底膜进入肝窦腔内。这种变化随冷保存时间延长更趋明显。但是肝脏在UW液中保存24h SEC只丧失少量活性 ［13］ 。本研究结果显示，两组肝脏UW液冷保存24～48h SEC均有损伤，但是DXR组损伤程度明显减轻。DXR组冷保存24h，SEC形态基本正常，至36～48h有部分SEC变圆、脱离基底膜，对照组在冷保存24h后部分SEC即出现明显的变圆、脱离基底膜，至36～48h更趋严重，各时间段DXR组保存液中透明质酸（HA）含量显著较对照组低（P<0.05）。HA是一种高分子量的脂多糖，可被SEC特异并迅速地降解。HA被认为是SEC损伤的敏感指标 ［14］ 。这一结果说明，DXR预处理对SEC也具有保护作用。
肝脏冷保存超过12～18h，移植肝失败及移植 后感染的危险性增加。近几年来，应用预处理的方法来延长肝脏冷保存时间。先使肝脏接受急性亚致死性应激刺激，使肝脏表达热休克蛋白（HSP）、抵御其后遇到的致死性损伤。HSP的一个重要功能是保护细胞免遭低温、缺血和ROIs的侵袭 ［15］ 。Cheng ［16］ 报道，用热休克和锌化合物预处理，大鼠肝脏UW液保存24h，HSP72表达显著高于对照组。已有报道利用HSR预处理成功地使大鼠肾脏冷保存的时间由原来的24h极限延长至45h ［17］ 。DXR预处理对肝脏长时间冷保存损伤的保护作用可能是基于诱导供肝HSR表达HSP72。本研究用DXR诱导HSR使大鼠肝脏冷保存时间延长至48h，肝细胞和SEC的形态和功能均得以很好的保持，免疫组化结果亦显示各时间段DXR组肝细胞和SEC均有HSP72表达，说明预先诱导肝脏产生HSP72使肝脏提前进入应激状态，能够经受住长时间冷缺血的损伤。本研究结果提示，DXR预处理可使肝脏冷保存时间显著延长，DXR诱导肝脏表达HSP72可保护肝脏抵御长时间冷保存造成的损伤。
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作者单位:200025上海第二医科大学瑞金医院
（收稿日期:2004-06-22）
（编辑黄 永）