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【摘要】 目的 通过对去势后大鼠给予米索前列醇，了解米索前列醇对去势后大鼠早期骨丢失的保护。方法 选取鼠龄90d的Wistar雌性大鼠共30只，分为正常对照组（对照组）、去势组（去势组）、去势给米索前列醇组（去势给药组）。去势后第2d，去势给药组予以2mg/（kg·d）剂量的米索前列醇生理盐水溶液灌胃，其余两组给予相同体积的生理盐水灌胃，于术后28d对各组的骨密度进行检测，并取第1腰椎脱钙切片，对各组骨小梁进行形态学分析。结果 骨密度检测结果显示:对照组最高，去势给药组次之，而去势组最低，3组之间两两比较差异均有显著性（P<0.05）;骨小梁面积:对照组最高，去势给药组次之，去势组最低，3组之间两两比较差异均有显著性（P<0.05）;骨保护素的表达量:对照组最高，去势给药组次之，去势组最低，3组之间两两比较差异均有显著性（P<0.05）。结论 米索前列醇可抑制去势后雌性大鼠骨量的丢失，其机制可能是通过刺激骨保护素的表达及分泌，来减少骨量的丢失。
关键词 米索前列醇 骨密度 骨保护素 逆转录聚合酶链反应
The effect of misoprostol on the bone of ovariectomized rats
Zheng Xiannian，Chen Liaobin，Shang Liang.
Department of Orthopedics，Zhongnan Hospital，Wuhan University，Wuhan430071
【Abstract】 Objective To investigate the influence of misoprostol on bone mineral density（BMD）in ovariecˉtomized（OVX）rats.Methods 30female Wistar rats aged90d were divided into3groups:Sham，OVX，OVX+misoprostol with10rats in each group.The OVX+misoprostol group was treated orally2mg/（kg·d）misoprostol after28days.All rats were sacrificed for treatment，and BMD was measured by dual-enery X-ray absorption，and reˉverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR）examination indicated the expression of OPG on mRNA level in tibial metaphyses.The first lumbar vertebrae was processed for histomorphometric analysis.Results The BMD of rats show that Sham group was the highest one，while the OVX+misoprostol group was higher than OVX group.There was significant different between the Sham group，OVX group and OVX+misoprostol group.The OPG of3groups of rats showed significantly differenttoo.OVX+misoprostol group was higher than OVX group，and OVX group higher than Sham group.Parameters of bone histomorphometric analysis showed that Sham group was the highest one，while the OVX+misoprostol group was higher than OVX group.Conclusion Misoprostol can effectively preˉvent osteoporosis in ovariectomized rats by up-regulation OPG mRNA level and inhibit osteoclastic bone resorption.
Key words misoprostol bone mineral density osteoprotegerin revevse transcriptiou-polymerase chain reˉaction
骨质疏松症（Osteoporosis）是以骨量减少，致使骨的脆性增加而易发生骨折的一种全身性骨骼疾病，它以骨的微观结构退化为特征 ［1］ 。随着社会的老龄化，骨质疏松症患者也越来越多，尤其是绝经后妇女最为突出。寻找安全有效的治疗方法成为当前研究的热点，现在临床上治疗骨质疏松症的药物和方法都很多。米索前列醇（misoprostol）是前列腺素E 1 的类似物，在临床上广泛应用于内科、妇产科和器官移植。有报道米索前列醇能够刺激体外培养的成骨细胞分泌骨保护素，提示米索前列醇有可能影响骨量的改变。本实验通过给予骨质疏松症的模型动物米索前列醇，比较骨密度（bone mineral density，BMD）和骨小梁面积，来研究米索前列醇能否预防去势后大鼠早期骨的丢失，并通过对骨保护素的逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测，以此来初步探讨米索前列醇影响骨量改变的原理，为防治绝经后骨质疏松寻找一种新的治疗药物。
1 材料与方法
1.1 研究对象及模型的制作 研究对象:3个月龄雌性Wistar大鼠30只，体重为200±5g。动物模型制作:背侧入路法，在大鼠髂棘顶部外上方1cm左右，腰椎骶嵴肌两侧作纵行切口长约0.5cm，打开后腹膜后，找到卵巢，卵巢是呈深红色颗粒状组织，多被周围脂肪组织所掩盖，提起后丝线结扎并切除卵巢。对照组只切开，不切除组织。
1.2 动物实验 将大鼠分成对照组、去势组、去势给药组，每组10只。模型制作术后第2天去势给药组开始以0.2mg/（kg·d）剂量 ［2］ 的米索前列醇（上海华联制药厂生产）生理盐水溶液灌胃，对照组、去势组以同体积的生理盐水灌胃。每周测量体重变化，以更改用药剂量。术后28d取材。
1.3 检测指标
1.3.1 骨密度检测 所有大鼠取材前用骨密度仪（NORˉLAND XR-32）行全身平均骨密度检测。
1.3.2 H-E切片分析 取所有大鼠第1腰椎椎体，采用EDTA脱钙后石蜡包埋切片，片厚5μm，H-E染色。对每组骨小梁面积通过病理图文分析系统进行计算。
1.3.3 骨保护素的检测 以β-肌丝蛋白为内参，设计两对引物分别为OPG特异性引物和β-肌丝蛋白引物（上海生物工程公司合成OPG上游为5’-TGTCCGˉGATGGGTTCTTCTCAGGT-3’，下游为5’-TTCˉCCAGGCAAGCTCTCCATCAAG-3’，β-actin目的扩增片段长约482bp;上游为5’-GTTTGAGACCTTCAACACCC-3’，下游为5’-GTGGCCATCTCTTGCTCGAAGTC-3’，目的扩增片段长约318bp） ［3］ 。
取材时1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，抽心脏血处死，取大鼠右侧胫骨干骺端，骨块重30mg，迅速投入液氮中冷冻，取出后在装有液氮的碾钵中碾碎。将骨块放入lml TRIˉZOL中，充分裂解。4℃，12000rpm离心10min，移上清于一干净离心管内。室温孵育5min，加入200μl氯仿，剧烈振荡15s，室温孵育3min。4℃，12000rpm离心10min，吸上层水相500μl于新管，加入500μl的异丙醇，充分混匀，室温孵育10min。4℃，12000rpm离心10min，弃上清。加入lml75%乙醇振荡混匀;4℃，7500rpm离心10min;弃乙醇，空气干燥20min。沉淀用50μl无RNase水溶解，并保存于-70℃。取2μl1%琼脂糖凝胶快速电泳。另取5μl稀释20倍，于紫外分光光度计下测量，OD260/OD280在1.877。
按试剂盒（Amersham Bioscience公司产品）提供的方法。取8μl总RNA，65℃作用10min，迅速冰浴。加入第一链反应混合物5μl及二硫苏糖醇（DTT）1μl，随机引物1μl，37℃反应1h，产物置于-20℃保存。
在50μl反应体系中，加入上述合成的第一链cDNA l5μl、OPG特异性引物、Taq酶2.5u、10m MdNTP1μl、10×缓冲液5μl;在另一50μl反应体系中加入β-肌丝蛋白引物各1μl其余成分同前。反应程序为:94℃预变性5min;然后进行30个循环的扩增（94℃变性1min，55℃退火1min，70℃延伸1min）;最后70℃延伸7min。
称取琼脂糖，与TBE缓冲液配制1.0%凝胶，微波炉内煮沸，稍冷却后加入10%EB2μl。取扩增产物8μl与2μl0.25%溴酚蓝上样，与250bp Marker4μl作电泳45min后紫 外灯观察，并照相保存。
1.4 统计学方法 将所得的数据用SPSS11.0软件进行统计学分析，进行t检验，设定P<0.05差异有显著性。
2 结果
2.1 骨密度情况比较 见表1及图1。
表1 骨密度情况比较 （略）
注: ˇ 与对照组比较P<0.05， # 与去势组比较P<0.05
图1 骨密度情况比较（略）
骨密度检测显示骨密度对照组稍高于去势给药组，而去势组骨密度最低。
2.2 H-E切片结果 见表2及图2。
表2 平均骨小梁面积比较 （略）
注: ˇ 与对照组比较P<0.05， # 与去势组比较P<0.05
图2 H-E切片结果比较（略）
平均骨小梁面积结果显示对照组>去势给药组>去势组（均P<0.05），并可从图2可见对照组骨小梁粗大髓腔正常大小;去势组骨小梁细小且有断裂现象，髓腔宽大;去势给药组介于两者之间。
2.3 RT-PCR结果比较 见图3、图4。RT-PCR琼脂糖 凝胶电泳照片如图3所示，右图显示OPG电泳带，左图显示β-actin电泳带。以β-actin作为参照对象，对所得照片进行图象分析。用OPG与β-actin光密度之比作为分析数据，所得数据如图4所示。
3 讨论
绝经后骨质疏松的治疗药物和方法有很多，如性激素、降钙素、维生素D、双磷酸盐类等等，现临床上比较常用的就是雌激素替代疗法，效果比较肯定，但长期服用有较多副作用，可引起子宫内膜增生、阴道出血，并可使子宫内膜癌发病率上升。现已有重组骨保护素用于去势大鼠的实验研究 ［5］ ，并取得好的疗效，但生产较困难及价格高，并且安全性未得到长期监测，不能广泛应用于临床。寻找一种较为安全、易得、价廉的药物成为目前研究的重点。
用去势后大鼠构建骨质疏松症的模型，是一种成熟的技术，本次实验检测到去势后大鼠的骨密度较正常对照组明显下降，说明本实验成功构建了骨质疏松模型。利用这种骨质疏松模型，去势后立即给予米索前列醇，研究它对绝经后骨质疏松的预防作用。从骨密度结果中可以看出去势给药组骨密度稍低于正常组，但明显高于去势组，说明给予米索前列醇能有效减慢去势后大鼠骨量的丢失。H-E切片对骨小梁的分析显示平均骨小梁面积正常组最高，去势给药组次之，去势组最低，同样也证明了米索前列醇减慢去势后大鼠骨量的丢失。并应用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）来检测大鼠骨中的骨保护素的表达情况，从图4分析得到OPG mRNA的表达去势给药组>去势组>对照组（P<0.05），去势给药组最高说明米索前列醇能刺激OPG mRNA的表达，而去势组高于对照组是因为去势后反馈调节的原因，与文献报道一致 ［4］ ，去势给药组骨保护素表达量较去势组明显增高则可能是米索前列醇刺激成骨细胞分泌骨保护素增加所至，可以认为早期应用米索前列醇能减少骨量丢失的原因在于其能刺激成骨细胞分泌骨保护素。 米索前列醇是一种价廉易得的药物，有研究表明长期口服米索前列醇（1600μg/d）未出现明显副作用，只有轻微胃肠道不适症状出现 ［6］ 。在骨质疏松症的预防与治疗研究中，米索前列醇可作为一种安全的选择药物。
本实验提示米索前列醇能防治去势后发生骨质疏松，减少骨丢失，其机制可能为刺激成骨细胞分泌骨保护素来防止去势后骨质疏松的发生。
参考文献
1 郭世绂，罗先正，邱兴贵.骨质疏松基础与临床.天津:天津科学技术出版社，2001，1.
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（收稿日期:2004-09-29）
（编辑唐 城）
作者单位:430071湖北武汉武汉大学中南医院骨科