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【摘要】 目的 研究胃癌组织基质金属蛋白酶-7(MMP-7)基因表达与胃癌门静脉血道转移及胃癌病理特征之间的关系,探讨其临床意义。方法 采用逆转录聚合酶链反应（reverse transcriptase-polymerase chain reaction,RT-PCR)方法检测30例胃癌患者癌组织和正常黏膜MMP-7mRNA，采用RT-PCR方法检测30例胃癌患者和10例腹腔良性疾病患者门静脉血中细胞角蛋白20的mRNA（CK20mRNA)。结果 胃癌组织MMP-7mRNA表达率为60%（18/30），明显高于远端正常组织的（4/11）11%（P＜0.001）;胃癌组有MMP-7基因表达的门静脉血CK20mRNA检出率达83.3%（15/18），显著高于无MMP-7基因表达的（1/12）8.3%（P＜0.001）；MMP-7基因表达与组织分化、TNM分期和肿瘤浸润深度相关（P＜0.05）；对照组门静脉血中CK20mRNA均为阴性。结论 MMP-7基因表达与胃癌血行转移有关，参与了胃癌的浸润、转移过程，有助于判断预后，MMP-7基因表达阳性的胃癌患者应尽早行全身化疗。
【关键词】 胃肿瘤；肿瘤细胞；聚合酶链反应；细胞角蛋白20；基质金属蛋白酶-7；转移
Expression of MMP-7 gene in gastric cancer tissues and its correlation with metastasis in portal vein blood
ZHANG Chang-le,XIANG He-ping.
Department of Surgery, The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei 230000, China
【Abstract】 Objective To study the expression of matrix metalloproteinase-7 (MMP-7) mRNA in gastric cancer and the relationship with clinicopathologic factors and metastasis in portal venous blood,explore its clinical significance.Methods Reverse transcriptase-polymerse chain reaction(RT-PCR)was used to detect the MMP-7 mRNA in tumor tissues and in the surrounding normal tissues of 30 patients with gastric cancer,RT-PCR was used to detect the CK20 mRNA in portal venous blood of 30 patients with gastric cancer and 10 patients with benign disease who underwent laparotomy served as controls.Results The positive rate of MMP-7 mRNA in tumor tissues 60%(18/30)were significantly higher than those the surrounding normal tissues 11%(4/11),(P＜0.001). The positive rate of CK20 mRNA of portal venous blood in patients with MMP-7 mRNA expression(83.3%,15/18)were significantly higher than those without MMP-7 expression (8.3%,1/12),(P＜0.001). The overexpression of MMP-7 mRNA was also related to different gastric cancer cell line,the TNM classification and the stage of the cancer (P＜0.05).None of 10 patients with benign disease was positive.Conclusion MMP-7 gene may play a role in the blood metastasis of patients with gastric cancer. All the patients with over expression of MMP-7 mRNA should be chemical cured as soon as early and it also can be helpful to the judgement of prognosis of gastric cancer.
【Key words】 stomach neoplasm;tumour cells;reverse transcriptase-polymerase chain reaction;cytokeratin 20;MMP-7;metastasis
胃癌是常见的恶性肿瘤之一，在我国发病率及死亡率居各种肿瘤之首，转移是胃癌的主要死亡原因。胃癌的浸润和转移是多步骤的复杂过程，其机制尚不清楚，但基底膜和细胞外基质（extracellular matrix,ECM）的降解是其中的必要条件。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase,MMP）家族已被证明可以降解基底膜和ECM，与肿瘤的浸润和转移密切相关［1］，它的高表达与癌细胞的浸润和转移特性相关［2］。肿瘤的血液转移与胃癌患者的预后密切相关，及早检出血液中的癌细胞，进而采取有效的阻断治疗，是提高疗效的关键，RT-PCR检测具有高度敏感性和特异性，可在106～107个正常细胞中检测出1个癌细胞，被认为是目前检测微转移的最有效方法［3］。成功的肿瘤微转移的检测取决于是否具有适当的肿瘤标志物。CK20由Moll［4］等于1990年发现，含42个氨基酸，分子量为48553，等电点为566，为酸性CK。不同于其他CK，CK20具有更为严格的上皮组织特异性，在正常组织中CK20见于胃黏膜，幽门腺体细胞，十二指肠黏膜，肠黏膜，泌尿系伞状细胞，表皮MerKel细胞，而其他组织如血液、淋巴细胞、平滑肌、乳腺等均为阴性，且CK20在细胞发生化生、癌变、肿瘤转移、体外培养等改变时，持续阳性表达［5，6］。检测胃癌患者血液CK20可作为癌细胞血液播散的标志，有助于判断胃癌患者有无血液转移。
1 资料与方法
1.1 一般资料 收集本院2003年5月～2004年5月收治的胃癌病人30例为实验组，全部病例均经胃镜病理证实；术前检查无其他部位的恶性肿瘤；术前未接受放疗和化疗；全部病例均经手术切除治疗。收集本院同期住院开腹手术的良性疾病患者10例，作为对照组。实验组男18例，女12例；年龄38～77岁，平均年龄59.5岁。
1.2 标本采集 于手术进腹后立即寻找到胃网膜右静脉，置入导管至门静脉，抽取各5ml门静脉血，立即以肝素抗凝存于-70℃低温冰箱中保存，留待检测血CK20mRNA。胃癌标本离体后，如有大体浆膜浸润，先描记浆膜受侵范围，随后立即取一小块肿瘤组织及一小块距肿瘤5cm以上正常胃黏膜组织作为对照，用生理盐水及0.1%焦碳酸乙二酯（DEPC）冲洗后存于-70℃低温冰箱中保存留待检测MMP-7mRNA，所有器械均经0.1%DEPC液浸泡24h去RNA酶处理。
1.3 引物 根据GenBank核酸数据库MMP-7（NM002423）、CK20（X73502）：使用Primer Premier 5.0设计3对引物：MMP-7：目的基因扩增片段长286bp;sense:5′-GAGACTTACCGCATATTACA-3′;antisense:5′-GAATGTCCCATACCCAAAC-3′。CK20:目的基因扩增片段长280bp；sense:5′-GAACAGGCTCAGGACTATCT-3′；anti-sense:5′-CCACTGTAATATGCGGTAAG-3′。-actin:目的基因扩增片段长510bp;sense:5′-CCCTGGACTTCGAGCAAGAGAT-3′;anti-sense:5′-GATTTTCTGCGCAAGTTAGG-3′;以上引物均由大连Takara公司合成。
1.4 实验方法 使用Tris试剂盒提取总RNA，使用mRNA纯化试剂盒分离MMP-7mRNA和CK20mRNA，以MMP-7mRNA和CK20mRNA为模板，经逆转录得到cDNA进行PCR扩增，反应参数为：94℃预变性5min，94℃1min,50℃1min,72℃1min,共32个循环，最后72℃延伸15min。
1.5 结果判定 RT-PCR产物置1%琼脂糖凝胶电泳（5V/cm）观察结果，溴乙啶染色，紫外线下照相，RT-PCR部分电泳条带MMP-7在286bp、CK20在280bp处有清晰、明亮条带者为阳性，无此条带者为阴性，应用捷达801专业数码凝胶成像与分析系统3.3分析电泳结果。
1.6 统计学方法 所有资料均录入SPSS10.0统计软件包处理：四格表组间率的比较主要采用Fish确切概率法，配对资料比较采用McNemar配对χ2检验，以P＜0.05为差异有显著性的标准。
2 结果
2.1 MMP-7mRNA在胃癌组织及远端正常黏膜的表达 在30例胃癌组织中有18例表达MMP-7mRNA，表达率为60%（18/30），而远端正常组织中仅有4例表达MMP-7mRNA，表达率为11%（4/11），经配对χ2检验，差异有非常显著性（χ2=14.067,P＜0.001)。胃癌组织及远端正常黏膜MMP-7mRNA的RT-PCR产物的电泳结果见图1。M：DL2000DNA标准；1～4：胃癌组织MMP-7mRNA的RT-PCR表达结果；5～8：远端正常黏膜
MMP-7mRNA的RT-PCR表达结果 图1 胃癌组织及远端正常黏膜MMP-7mRNA的RT-PCR表达结果（略）
2.2 胃癌组织MMP-7mRNA表达与门静脉血CK20mRNA检出率关系 在对照组中10例病人中，CK20mRNA检测均为阴性结果，未发现假阳性情况。在30例胃癌病人中，门静脉血CK20mRNA可检出16例，检出率为53.3%。从胃癌组织MMP-7mRNA和门静脉血CK20mRNA检测结果可以看出，在18例有MMP-7基因表达的病例中，门静脉血CK20mRNA检出15例阳性，检出率高达83.3%，而12例MMP-7基因表达阴性的病例门静脉血CK20mRNA只检出1例阳性，检出率为8.3%，差异有非常显著性（P＜0.001)；见表1。门静脉血CK20mRNA的RT-PCR产物电泳结果（见图2）图2 对照组与胃癌患者门静脉血CK20mRNA的RT-PCR表达结果（略）
。表1 胃癌组织MMP-7基因表达与门静脉血CK20mRNA检出率的关系（略）
2.3 胃癌组织MMP-7mRNA的表达与胃癌病理特征之间的关系 胃癌组织MMP-7mRNA检测结果表明癌组织中MMP-7mRNA的检出率与组织分化、TNM分期及肿瘤浸润深度相关（P＜0.05)；而与有无淋巴结转移及浆膜浸润范围不相关（P＞0.05)。在分化差（低分化、未分化、黏液腺癌、印戒细胞癌）的病例中，胃癌组织MMP-7mRNA检出率高达76.5%（13/17），显著高于分化良好（高分化、中分化）癌的38.5%（5/13），差异有显著性（P=0.035)；在Ⅲ+Ⅳ期胃癌中癌组织MMP-7mRNA阳性率高达72.7%（16/22)，与Ⅰ+Ⅱ期的25%（2/8）相比，差异也有显著性（P=0.034）；胃癌患者其肿瘤浸润深度达到深肌层
见表2。M：DL2000 DNA标准；1～10：RT-PCR法检测胃癌患者门静脉血CK20mRNA结果；11～12:RT-PCR
法检测对照组门静脉血CK20mRNA结果 高于 表2 胃癌组织MMP-7mRNA检出率和胃癌病理特征的关系（略）
3 讨论
MMP-7属于MMP基因家族的成员之一，其分子量最小，为28kD。它缺乏C末端区域，而分子结构中C末端区域为基质金属蛋白酶组织抑制剂（TIMP）与MMP相互作用的区域，调节着TIMP的活性，因此MMP-7具有强大的基质降解活性和广泛的底物特异性，其中包括Ⅳ型胶原、层黏蛋白、纤维结合素、蛋白多糖、Ⅰ型明胶和可溶性弹性蛋白等底物，同时受TIMP的负调节较小。这也是MMP-7在胃癌中比其他MMP家族成员起重要作用的分子基础。MMP-7基因定位于11q21-q22,其cDNA长1094bp,编码267个氨基酸［7］。在正常组织中，MMP-7表达于子宫内膜的分泌性导管上皮细胞，同时也可表达于各种外分泌腺，如乳腺、肝内导管和皮肤汗腺等。进一步研究表明MMP-7在各种癌组织中呈过度表达，其中包括乳腺癌、前列腺癌、胃癌、大肠癌、胰腺癌、肺癌、肾癌等［8，9］。各种MMP在癌组织中表达时都位于基质细胞中。然而MMP-7却表达于肿瘤细胞中，在基质细胞中并不表达。同时MMP-7不仅表达于肿瘤细胞中而且在表达MMP-7的肿瘤细胞临近的血管内皮细胞中也有表达［10］。正常细胞或肿瘤细胞分泌MMP-7时，都是以无活性的酶原（ProMMP-7）形式存在。ProMMP-7能被多种因素激活，同时MMP之间也能通过相互作用调节自身的活性。由此可见，在生理或病理条件下，MMP-7通过与MMP家族其他成员如MMP-1、3、9的相互作用而共同调节ECM的降解过程。MMP-7在肿瘤组织和周期性子宫内膜中的表达，提示MMP-7像其他MMP家族成员一样，可能被原癌基因、生长因子（如EGF）、激素及一些细胞因子（如IL-4、IL-10、INF-γ)等所调节［11］，但是基因调控机制尚不清楚。穿透宿主组织的能力是肿瘤细胞浸润和转移的必要前提，肿瘤的浸润和转移过程涉及ECM的破坏。MMP系统参与了生理与病理性基质的降解，尤其是MMP-7。肿瘤细胞通过分泌MMP-7来降解构成基底膜的ECM成分，从而破坏了机体防御肿瘤浸润与转移的自然屏障，增加了癌细胞的侵袭性，促使了肿瘤的浸润和转移。国内外均有学者报道MMP-7在胃癌中主要在深部的癌巢尤其是浸润的前方表达，这更能代表肿瘤的浸润活性［12，13］。Itoh等［14］用MMP-7基因传染体外培养的结肠癌细胞，发现MMP-7的表达高的细胞系在琼脂糖培养基上呈蟹爪样生长，而MMP-7表达低的细胞系则呈团块样生长，所以无论从临床表现还是体外实验，都表明MMP-7参与了肿瘤细胞的直接浸润。Matsushima J等［15］认为MMP-7可以作为判断直肠癌是否有神经浸润的良好指标。最近研究显示，膜相关和可溶性的MMP能够调节细胞生长、分化和信号转导［16，17］。这可能与MMP裂解跨膜蛋白（如生长因子的配体和受体）的胞外区域有关。Noe V等［18］也证实了上述现象，并发现这种裂解作用可能被MMP-7通过裂解细胞表面的E-cadherin，并释放可溶性的E-cadherin的作用。由于E-cadherin在肿瘤的浸润与转移中发挥了重要的对抗作用，所以MMP-7也间接地促进了肿瘤的浸润与转移，这可能是MMP-7影响肿瘤侵袭的一种新机制。
本研究显示30例胃癌中MMP-7基因表达阳性率为60%，而远端正常组织的阳性率为11%，差异有非常显著性（P＜0.001），与中外学者研究相符［19，20］。本研究同时检测了MMP-7基因表达与组织分化、淋巴结转移、TNM分期、浆膜浸润范围和肿瘤浸润深度的关系，结果显示MMP-7基因表达与组织分化、TNM分期和肿瘤浸润深度相关（P＜0.05），而与淋巴结转移和浆膜浸润范围不相关（P>0.05）。杜月光等［20］曾检测了高分化的胃癌细胞株MKN28和低分化的胃癌细胞株DATOⅢ、MGC-802,SGC-7901中MMP-7表达情况。结果显示，高分化的MKN28细胞株MMP-7表达弱阳性，而低分化的胃癌细胞株则MMP-7表达强阳性，并对细胞株的习性分析，低分化的胃癌细胞株有明显的转移能力。郭源等［21］的研究结果发现MMP-7的mRNA表达与肿瘤浸润深度呈正相关，同时MMP-7的表达量在肿瘤Ⅲ、Ⅳ期比Ⅰ、Ⅱ期高。分析认为浸润性生长是恶性肿瘤的重要特征，MMP-7的高表达可以导致ECM降解加快，促进癌细胞浸润性生长，所以MMP-7过度表达与胃癌的浸润能力相关。Busiek等［11］的实验发现内毒素吞噬细胞介质，细胞因子和激素能刺激MMP-7的表达，MMP-7的生物合成能被淋巴因子L-4，L-10和IFN-γ抑制。Gambernardi等［22］的研究表明，myc、ras等癌基因能使MMP-7表达上调。可以推断，在胃癌的发生发展过程中，出现癌基因的激活、抑癌基因的缺失，肿瘤细胞信号传导的改变，引起MMP-7基因的转录、表达增高，从而导致细胞外基质降解，加速肿瘤浸润性生长，所以MMP-7的表达量在肿瘤Ⅲ、Ⅳ期比Ⅰ、Ⅱ期高。Yamashita等［23］、Senota等［24］、焦春宇等［12］的研究均发现胃癌组织中MMP-7表达在有淋巴结转移的病例明显高于无转移者，差异有显著性（P＜0.05)。本研究结果在淋巴结转移方面之所以显示不同结论，分析本组30例病例，有淋巴结转移的23例，而无淋巴结转移的仅7例，我们认为本组多为中晚期胃癌，是淋巴结转移阴性病例较少导致结果偏差，因为从数据上看它们之间有一定的差异，增加病例会增大显著性。本研究重点检测了MMP-7基因表达与门静脉血道转移的关系，结果显示MMP-7基因表达与门静脉血道转移密切相关（P＜0.001)。新生的毛细血管在肿瘤组织中的形成为肿瘤细胞进入血循环提供了入口，在肿瘤血管形成的起始阶段，内皮细胞受肿瘤源性血管生长因子的刺激，迁移到肿瘤组织中，随后降解基底膜和周围的ECM。MMP-7和血清蛋白酶在内皮细胞的迁移过程中起着关键的作用。MMP-7具有广泛的底物特异性和强大的基质降解能力，从而在肿瘤血管生成的过程中促进了内皮细胞的迁移，同时在内皮细胞中表达的MMP-7的蛋白水解活性松散了血管的结构，从而使肿瘤细胞更易浸润血管。可见，MMP-7表达阳性的肿瘤患者其癌细胞更具血管侵袭性，促进了肿瘤的血行转移。
目前胃癌的诊断主要靠术前的胃镜病理检查，因此在胃镜下取肿瘤标本时常规行MMP-7mRNA检测，有利于了解胃癌的浸润和转移特征，以便采取相应的治疗措施，能提高疗效。随着基因芯片技术的飞速发展，采用RT-PCR方法在术中检测胃癌组织MMP-7mRNA的表达能瞬间得到结果，且具有高度的敏感性。本研究结果表明癌组织中MMP-7的表达与组织分化、TNM分期、肿瘤浸润深度和门静脉血CK20mRNA检出率相关（P＜0.05），有淋巴结转移的病例癌组织中MMP-7表达亦明显高于无淋巴结转移的病例。因此对有MMP-7表达的胃癌患者术中应尽量切除原发病灶及周围可能浸润的组织、彻底清扫转移的淋巴结是非常必要的，它可以在最大限度上减少肿瘤负荷。对于胃癌病人而言，一旦门静脉血液中有CK20mRNA的表达，就意味着胃癌细胞已经播散入血液循环，门静脉血液内癌细胞阳性即意味着肿瘤已无法根治切除，此种病人应视为形成远处转移及术后复发的高危病人。虽然门静脉血中癌细胞阳性的病例有远处转移的可能，但与已经发生临床远处转移有本质不同，改善该类患者预后的关键在于及时有效地杀灭血液循环中癌细胞，将微转移消灭在亚临床状态。对于这种病人，应加强术后监测，及早采取必要的措施。我们认为这种病人有采用全身化疗的明确指征，术后2周即开始并定期给予全身化疗，也是提高疗效的关键。另外对有MMP-7表达的胃癌患者，我们建议术中通过门静脉插管给予化疗药物，也可能杀灭进入门静脉血的癌细胞，达到预防和治疗胃癌血行转移的目的。
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作者单位： 230000 安徽合肥,安徽医科大学第一附属医院
(编辑：毅 文)