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缺血性脑血管病具有发病率高、致残率高和死亡率高等特点，严重威胁着人类健康，国内外主要采用改善脑循环、促进脑代谢、抗凝及脱水等药物治疗，对缺血半暗带的损伤显示了一定的治疗效果，但不能使已坏死的神经细胞元再生，对于已发生缺血坏死的脑组织，临床疗效不满意。因此，有必要寻找一种切实有效的修复受损脑组织的治疗方法。研究表明，骨髓基质细胞（marrow stromal cells,MSCs）具有多向分化潜能，不但能分化为造血实质，支持造血，还能够在适宜的诱导条件下，分化为多种造血细胞以外的组织细胞，如心肌细胞、成骨细胞和神经元等，并且具有来源广泛、取材简便、扩增迅速、易分离、纯化和培养等特点，成为细胞治疗和基因治疗的有效载体。以其作为神经修复的种子细胞，治疗脑缺血性疾病，正逐渐受到人们的广泛关注，做了大量的研究工作，并取得了一些研究成果，本文就MSCs神经分化潜能与脑缺血性疾病的治疗进行分析和总结。
1 MSCs的发现
最早提出骨髓具有造血以外功能的是德国病理学家Cohnheim，他在1967年，研究损伤修复时注射一种可溶性染料到动物的静脉中，然后在损伤处寻找含有染料细胞的出现，他认为出现于损伤处的大部分细胞来源于血液，也可以说是来源于骨髓。到20世纪70年代，Friedenstein［1］将整个骨髓放置于塑料培养皿中，在去除非贴壁细胞后，观察到呈梭形的贴壁细胞，并形成2个或者4个细胞的小灶，2～4天后开始迅速分裂，经传代及培养后这些细胞成为均一的梭形，这些细胞具有多向分化潜能，当时表现为类似于骨或软骨的特性，这些细胞聚集落就是骨髓基质细胞。
2 MSCs的生物学特点
MSCs在骨髓中含量稀少，约1×105～1×106个单核细胞中才含有一个MSCs,并且随着年龄的增加而逐渐减少。现在普遍认为MSCs主要由3类细胞组成:较小的梭形细胞、较大而扁平的成熟细胞以及自我更新速度快、极小的圆形细胞，它较其他细胞有更强的多向分化潜能。采用流式细胞技术对人的MSCs的进行研究发现，人MSCs表达多种表面标志，细胞贴壁后均一地表达SH2、SH3、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD120a、CD124等多种细胞表面蛋白，不表达造血谱系的标志，包括CD14、CD34和白细胞共同抗原CD45等，也未在扩增的MSCs的鉴定出造血干细胞来［2］。因此MSCs明显不同于其他CD34表面抗原阳性的造血干细胞。但是至今没有找到MSCs特异性抗原标记，鉴定MSCs目前主要依赖其形态水平。
3 MSCs向神经细胞分化
3.1 体内实验 Eglitis等［3］在研究小胶质细胞、星形胶质细胞来源时，将成年雄性小鼠的骨髓或反转录病毒载体标记的骨髓细胞静脉注射到经亚致死量射线照射的雌鼠体内，发现移植的MSCs通过大脑皮层到达脑干，一些供体源骨髓表达少突胶质细胞的表面标记F4/80或星形胶质细胞的表面标记神经胶质纤维酸性蛋白（glia fibrillary acidic protein,GFAP）。Azizi等［4］将人类的骨髓基质细胞植入鼠纹状体，发现大约20%的植入细胞发生迁移，即从脑室下带沿着白质束迁移到皮质、纹状体、前脑和小脑等部位，未发现炎症和免疫反应，迁移后会失去骨髓基质细胞在培养中的典型特征而表达星形胶质细胞的特征。Kopen等［5］将鼠的MSCs用5溴-2脱氧尿苷（BrdU）标记注射到胎鼠侧脑室，12天后处死小鼠，观察到MSCs已经通过血脑屏障，向前脑和小脑方向迁移，并且没有破坏脑部组织，在纹状体、海马的分子层MSCs表达GFAP，提示其已经分化为星形胶质细胞；在海马嗅觉小岛、嗅球、小脑内颗粒层等神经元分布丰富的部位，也发现MSCs并表达巢蛋白（nestin）；在中脑的网状结构还发现MSCs表达神经元中间丝蛋白（NF-M），神经元特异性核内抗原（NeuN）等。以上这些研究均显示，MSCs在体内具有向神经元方向分化的潜能。
3.2 体外实验 体外研究结果也显示，通过一定诱导条件，MSCs可表现出神经系统细胞的一些形态特点和标志性蛋白。目前体外诱导MSCs向神经细胞分化的方法主要有长生因子诱导、抗氧化剂诱导、增加MSCs内cAMP诱导等三种诱导方式。
3.2.1 生长因子诱导 Sanchez-Ramos J等［6］建立含表皮生长因子（EGF）、成纤维细胞生长因子（bFGF）、马及胎牛血清（FBS）、转铁蛋白、黄体酮、腐胺、硒等体外培养系，采用神经生长因子（NGF）、脑源性神经生长因子（BDNF）及全反式维甲酸进行诱导7～14天，发现有神经前体细胞标记物nestin、NeuN和GFAP的表达。Reyes等［7］以人 MSCs中缺乏CD45+血型糖蛋白A的黏附细胞族为研究对象，用低糖的DMEM为培养基，在纤维结合素包被的载玻片用碱性成纤维细胞生长因子诱导3周，形成以微管蛋白（β-tubulinⅢ）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）和微管相关蛋白（MAP）等为标志的神经元。Tohill等［8］用神经胶质生长因子（glial growth factor,GGF）来诱导MSCs分化，结果MSCs也表达GFAP。
3.2.2 抗氧化剂诱导 Woodbury等［9］报道，将鼠和成年人的MSCs先在含β-巯基乙醇（ME-2）的DMEM/FBS中培养24h以启动MSCs的神经元分化，随后在含丁羟基苯甲醚，二甲亚砜的DMEM中培养，60min内MSCs即有神经元形态学的改变，1周之内，超过50%的MSCs出现神经元形态学的改变，表现为细胞突起终止于典型的生长锥和丝状假足，且以神经元标记物NSE、NF-M或Tau增高为主，值得关注的是国内学者充分发挥祖国中草药优势，为体外诱导MSCs向神经分化展示了另一诱人的前景。肖庆中等［10］采用麝香多肽诱导MSCs，发现成年大鼠MSCs在加入麝香多肽诱导后，细胞体收缩，突起伸出，形似神经元；免疫组化显示神经元样细胞NSF、NF、nestin表达阳性，GFAP阴性，且NSE、NF阳性的神经元样细胞的比例高达93.5%和88.2%，呈成熟神经细胞特点。
3.2.3 增加MSCs内cAMP诱导 Deng等［11］于MSCs培养基内加入磷酸二酯酶抑制剂3异丁基-1-甲基黄嘌呤（IMBX）和cAMP类似物双丁酰环磷腺苷（dbcAMP）。2天后，MSCs开始出现形态学改变，胞体圆缩，突起延长变细。诱导6天，发现近25%的MSCs分化为典型的神经细胞形态；并且提高了NSE和房肽素的表达，采用Western blot检测，发现早期未成熟神经元标记物，微管蛋白、微管相关蛋白及波形蛋白（vimentin）表达增高，指出增加细胞内的cAMP水平可使MSC分化为早期的神经前体细胞。
4 MSCs治疗脑缺血性疾病的研究进展及机制
4.1 MSCs在脑缺血性疾病的治疗作用 Li等［12］将 Brdu标记的MSCs通过颈总动脉内灌注及纹状体局部注射来治疗发生大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion,MCAO）的脑缺血模型。28天后，可见Brdu阳性细胞存活并向缺血区迁移2.2cm，MSCs在缺血性脑损伤区存在活跃的代谢改变，其中1%表达NeuN，8%表达GFAP。尽管移植后脑梗死范围无明显改变，但神经功能有明显改善。Chen等［13］为MSCs植入脑内提供了一条更可行的途径，对MCAO动物模型进行静脉移植MSCs。他们从大鼠中收获MSCs，在不含或含有神经营养因子培养基培养，预先用BrdU标记，大鼠大脑中动脉闭塞 2h,24h后尾静脉细胞移植，14天后处死。结果表明，MSCs存活，迁移至缺血区并分化成了神经元。MSCs在脑注射治疗组与MCAO对照组相比功能明显恢复（P<0.05），NSS检测（modified neurological severity score tests）(P<0.05)。接受预先用NGF培养的MSCs的治疗组与MCAO对照组相比呈现明显的运动恢复（P<0.05），躯体感觉恢复（P<0.05）和NSS（P<0.05）。免疫组化检查发现MSCs在缺血半球积聚，已有部分细胞开始表达神经元的标志如MAP2、NeuN、GFAP。Li等［14］又将人骨髓间质干细胞（hMSC）经尾静脉移植给MCAO大鼠，结果hMSC并未诱导大鼠的脾细胞产生细胞毒性T淋巴细胞反应，处理后第14天，与对照组（未给予hMSC或未给予hMSC同种基因大鼠肝结缔组织细胞移植）比较，试验组大鼠的NSS均提高（P<0.05），由mAb1281标记的hMSC中有1%表达NeuN，1%表达MAP-2，5%表达GDAP，2%表达vWF，用TUNEL和HE染色可见缺血边缘区凋亡细胞数减少、室管膜/室下区（VZSVA）Brdu(-)细胞显著增加，并于处理后第7天时，观察到脑源性神经营养因子（BDNF）和神经生长因子（NGF）分泌水平增加（P<0.05）。
4.2 MSCs移植治疗脑缺血性疾病的可能机制 骨髓间质干细胞移植对脑缺血性疾病的治疗作用在不同的实验研究中得到证实，其作用机制是多方面的。首先，骨髓基质细胞可以通过血脑屏障，这一发现在理论和实践上为骨髓基质细胞移植应用于脑缺血性疾病治疗提供了可能［15］。Wang等［16］研究显示单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)能促进MSCs迁入缺血的脑组织。MSCs通过血脑屏障向病变部位迁移，对周围环境、细胞因子和一些信号作为反应，与周围组织发生联系，表达神经元特有的标志蛋白，MAP-2、NSE、NF和GFAP等［17］。与病变周围组织渗透融合、替代损伤细胞、重建神经环路，从而达到恢复神经功能的目的。但是，单纯几个表面标志的表达并不能确认MSCs成为神经细胞，能建立突触联系，进行整合、传递信息及合成递质等功能。Chen等［18］认为MSCs的营养支持在治疗中起重要作用。研究表明MSCs能够合成细胞外基质，包括Ⅰ型、Ⅱ型胶原蛋白（collagen）、纤维连接蛋白（fibronectin）和层粘蛋白（laminin）及分泌多种细胞因子如：IL-7、IL-8等，各种神经生长因子，如BDNF、bFGF、NGF、血管内皮生长因子（VEGF）和肝细胞生长因子（HGF）等，还可以合成集落刺激因子、骨形成蛋白（bone morphogenetic protein,BMP）及造血调节因子等，这些因子能产生神经保护作用和促进缺血区局部微血管再生，促组织回到“进化”状态，支持新生血管形成、神经再生和组织重构，从而起到治疗作用。此外，MSCs可能为缺血的脑组织提供了某种促分化因子，促进了宿主脑组织的神经干细胞和前体细胞的增殖、迁移、分化和成熟，生成新的神经元和胶质细胞，进而促进神经功能的改善［19］。
5 展望
MSCs移植应用于治疗脑缺血的研究已取得很大进步，但该领域的研究尚处于探索阶段，目前大部分仅停留在动物实验，尚未开展临床试验，仍有许多有待解决的问题，如：MSCs的移植入脑内的方式、途径及其分子机制；是什么信号诱导MSCs到达缺血损伤区，如何通过血脑屏障及在准确的位置种植及分化；MSCs在脑内分化为神经元的机制；细胞移植后能否整合入宿主的神经环路，能否与其他神经元产生突触联系进而分泌神经递质以及MSCs移植治疗脑缺血的生物安全性等问题有待于进一步的研究。
总之，MSCs进行细胞和基因治疗各种神经系统疾病具有与伦理学争议的胚胎干细胞和来源稀少、取材较困难、体外培养条件苛刻的神经干细胞、相比有明显的优势。尽管其发挥神经保护作用的具体机制尚不清楚，但随着对MSCs生物学特性的深入研究，MSCs新的分离、钝化、诱导系统的建立，MSCs移植动物实验及临床研究的开展将为脑缺血性疾病的细胞和基因治疗展示了光明前景。
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作者单位： 121001 辽宁锦州，锦州医学院附属第一医院
(编辑：宋 冰)