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【摘要】 目的 探讨糖尿病性膀胱发病机制中逼尿肌M3受体的改变情况。方法 以链脲佐菌素诱导2型糖尿病大鼠成模。应用尿动力仪检测逼尿肌收缩功能； Western blot、RT-PCR方法检测膀胱M3受体含量。结果 病程2周时糖尿病组大鼠膀胱逼尿肌收缩力增加伴M3受体表达增强；病程4周时糖尿病组大鼠膀胱逼尿肌收缩力低于正常对照组，但尚无统计学意义；病程12周时糖尿病组大鼠膀胱逼尿肌收缩力降低伴M3受体表达减少。结论 膀胱收缩功能和M3受体蛋白含量及M3受体mRNA的含量三者呈同向变化关系。在糖尿病大鼠发病早期三者均升高，但是随着病程进展却都降低了。这可能是早期糖尿病性膀胱病变的发病机制之一。
【关键词】 糖尿病性膀胱；逼尿肌；收缩功能；M3受体
Alteration of detrusor contraction and M3 subtype muscarinic receptors in the type 2 diabetic rat urinary bladder
YANG Yi-cheng.
Medical Station of Shuozhou Firefighter Division,Shuozhou 038500,China
【Abstract】 Objective To research into the alteration of detrusor contraction and M3 subtype muscarinic receptors in the diabetic cystopathy(DCP).Methods The type 2 diabetic rats were induced by the intraperitoneal injection of Streptozotocin (STZ) (90mg/kg) and high caloric diet.The identical-week-old Wistar rats were utilized as control rats. We studied the contractile functions of whole bladder. For determination of M3 muscarinic receptor mRNA in the bladder tissue, the method of RT-PCR was employed.The amount of M3 receptor protein in the rat bladder body tissue was measured by the method of Western blot. Results The results of the whole bladder contractile force showed that the contractile function of the 2-week diabetic rats bladder was increased.The contractile function of the 4-week diabetic rats bladder was decreased when compared to the control rats. When 1mmol/L Carbachol was existed, the contractile function of the 4-week diabetic rats bladder was decreased,but have no statistical significance. The contractile function of the 12-week diabetic rats bladder was decreased（P<0.01，n＝8）.M3 muscarinic receptor mRNA in the 2-week diabetic rats bladder was increased.The amount of M3 muscarinic receptor mRNA in the 4-week diabetic rats bladder was significantly decreased. The amount of M3 muscarinic receptor mRNA in the 12-week diabetic rats bladder was significantly decreased. Western blot demonstrated that the amount of M3 muscarinic receptor protein in the 2-week diabetic rats bladder was decreased.Conclusion These results suggest that the alterate trend of detrusor contraction, M3 muscarinic receptor mRNA and M3 subtype muscarinic receptors protein in the type 2 diabetic rat urinary bladder were similar.At the early stage of diabetes mellitus, However,as diabetes mellitus is developed,all of three factors are decreased.
【Key words】 diabetic cystopathy；detrusor；contraction；M3 muscarinic receptors
糖尿病性膀胱（diabetic cystopathy，DCP）是糖尿病最常见的慢性并发症之一，虽然其临床表现和严重危害早已被人们所认识，但其发病机制仍未阐明，故早期诊治比较困难。本实验研究2型糖尿病大鼠膀胱逼尿肌收缩功能改变和M3受体及M3受体mRNA的含量改变的关系，以期为阐明DCP的发病机制提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料 动物模型与分组：新生雌性Wistar大鼠2天龄60只（山西医科大实验动物中心，清洁型），体重15~20g，等级来源随机分成6组，对照组A1、B1、C1，每组10只，糖尿病组A2、B2、C2,每组10只。糖尿病组大鼠禁食12h，用200mg/ml链脲佐菌素（steptozotocin，STZ）溶液按90mg/kg体重剂量腹腔注射一次，待4周龄断乳时再以200mg/ml STZ 25~30mg/kg体重腹腔注射追加一次，并以高糖高脂饮食（18%猪油；20%蔗糖，3%蛋黄粉、59%基本饲料）饲喂。8周龄时以空腹尾静脉血葡萄糖浓度>11.1mmol/L为模型成功。正常对照组：不作特殊处理。两组均自由进食进水。3组分别于饲养10、12、20周时，即糖尿病病程2周、4周、12周时进行实验。
1.2 方法
1.2.1 离体全膀胱制备 腹腔注射乌拉坦100mg/kg麻醉后仰卧位固定大鼠,取下腹正中切口，结扎双侧输尿管，远离膀胱颈部离断尿道，完整取出膀胱，置于37℃、pH 7.4、充氧(95%O2，5%CO2)的Tyrodes液中(NaCl 125mmol/L，KCl 2.7 mmol/L，CaCl2 1.8mmol/L，NaH2PO4 0.4mmol/L，MgCl2 0.5mmol/L，NaHCO3 24.0mmol/L，葡萄糖5.6mmol/L)备用。
1.2.2 离体全膀胱收缩功能实验 取一硬膜外导管,一端经尿道插入离体膀胱并妥善固定；另一端经三通管分别连接微量灌注泵和尿动力仪,作膀胱灌注和测压之用，全部实验过程在37℃、pH 7.4、充氧(95%O2，5%CO2)的Tyrodes液中进行。首先将离体膀胱温育平衡30min，接着以0.2ml/min的速度用生理盐水进行膀胱灌注。膀胱最大容量的测定：恒速灌注,当膀胱压力上升达到前10min压力的2倍以上时记录容量，记为膀胱最大容量。排空膀胱后静置15min。Tyrodes液中加入1mmol/L Carbachol再次进行恒速灌注，当达到最大膀胱容量时记录膀胱压力的变化情况。
1.2.3 RT-PCR法检测M3受体mRNA表达水平 用Trizol法（上海生工产品）按照说明书提取总RNA。分光光度法测定RNA浓度后取2μg 应用MMLV第一链cDNA合成试剂盒（上海生工产品）进行逆转录反应合成第一链cDNA。应用Primer3.0软件进行引物设计，引物特征见表1。选用3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)为内参照。按照高保真即用PCR扩增试剂盒（上海生工产品）说明书进行PCR扩增反应，反应条件为：94℃，5min；94℃，40s；60℃，40s；72℃，40s（40个循环）；72℃，10min。PCR产物在1.6％的琼脂糖凝胶中100V恒压电泳约30min后，用复日FR-980生物凝胶电泳图像分析系统对电泳带成像并进行图像分析，测定其灰度值并计算M3受体与GAPDH的mRNA浓度比值用于定量比较。
1.2.4 Western blot法检测M3受体蛋白的含量 将膀胱组织置于液氮中研磨破碎后溶于pH 7.4的0.5ml Tris（50mmol/L）/EDTA (0.5mmol/L)缓冲液中，2000g离心10min后取上清，蛋白含量按改良Lowry法测定。取90μg蛋白样品经15％聚丙烯酰胺（PAGE），十二烷基磺酸钠(SDS)凝胶150V恒压电泳分离后，经100mA恒流半干电转膜至硝酸纤维素滤膜上，分别与M3受体多克隆抗体及相应二抗（武汉博士德产品）按照说明书进行反应。以β-actin肌动蛋白为内参照。将硝酸纤维素膜置DAB显色试剂中显色，并用复日FR-980生物凝胶电泳图像分析系统对电泳带进行图像分析，测定其灰度值并计算M3受体与β-actin肌动蛋白浓度的比值用于定量比较。
1.3 统计学方法 数据以（χ±s）表示，应用SPSS11.5软件进行统计学分析，数据分析采用析因设计的方差分析，结果以P<0.05为差异有统计学意义。
表1 M3受体和GAPDH的PCR引物序列 略
2 结果
2.1 离体全膀胱收缩功能实验 病程2周时糖尿病组大鼠膀胱逼尿肌收缩力高于正常对照组，为（16.94±3.39）VS（11.46±2.59）cmH2O／100mg 组织（P=0.04，n＝8），在1mmol/L Carbachol作用后糖尿病组大鼠膀胱逼尿肌收缩力显著高于正常对照组，为（31.96±4.42）VS（14.15±3.34）cmH2O／100mg 组织（P<0.01，n＝8）；病程4周时糖尿病组大鼠膀胱逼尿肌收缩力低于正常对照组，为（19.54±4.39）VS（25.43±5.24）cmH2O／100mg 组织（P=0.03，n＝8），在1mmol/L Carbachol作用后糖尿病组大鼠膀胱逼尿肌收缩力较正常对照组为低，为（23.88±4.12）VS（29.49±5.18）cmH2O／100mg 组织（P=0.055，n＝8）但尚无统计学意义；病程12周时糖尿病组大鼠膀胱逼尿肌收缩力低于正常对照组，为（17.00±6.28）VS（24.71±7.62）cmH2O／100mg 组织（P<0.01，n＝8），在1mmol/L Carbachol作用后糖尿病组大鼠膀胱逼尿肌收缩力低于正常对照组，为（20.33±6.14）VS（29.56±9.08）cmH2O／100mg 组织（P<0.01，n＝8）。
2.2 RT-PCR法检测M3受体mRNA表达水平 病程2周时糖尿病组大鼠膀胱逼尿肌M3受体mRNA的数量显著高于正常对照组，为（62.01±5.70）％VS（45.56±11.67）％(P<0.05，n＝8)；病程4周时糖尿病组大鼠膀胱逼尿肌M3受体mRNA的数量显著低于正常对照组，为（48.65±11.77）％VS（64.16±6.53）％(P<0.01，n＝8)；病程12周时糖尿病组大鼠膀胱逼尿肌M3受体mRNA的数量显著低于正常对照组，为（45.45±6.70）％VS（62.91±6.37）％(P<0.05，n＝8)。
2.3 Western blot法检测M3受体蛋白的含量 病程2周时糖尿病组大鼠膀胱逼尿肌M3受体含量显著高于正常对照组，为（34.90±2.06）％ VS（30.36±4.73）％（P<0.01，n＝8）；病程4周时糖尿病组大鼠膀胱逼尿肌M3受体含量显著低于正常对照组，为（23.99±2.28）％ VS（36.19±2.13）％（P<0.01，n＝8）；病程12周时糖尿病组大鼠膀胱逼尿肌M3受体含量显著低于正常对照组，为（23.20±0.79）％ VS（33.40±2.56）％（P<0.01，n＝8）。
3 讨论
DCP是指由糖尿病引起的膀胱功能障碍，主要体现在膀胱的排尿功能障碍。由于诊断标准和检测方法的不同，其发病率报道不一。在我国一般认为2型糖尿病中的发病率高于1型糖尿病，尿流动力学检查结果显示2型糖尿病中发病率约为60％，且女性占72％，显著多于男性，86％为40岁以上的中老年患者，病程越长发病率越高，未经治疗者较治疗者发病率高。临床表现主要为：尿意迟钝、尿频、尿急、急迫性尿失禁、逼尿肌无力、尿潴留、溢出性尿失禁、泌尿系感染、肾功能损害；也可表现为：尿失禁、逼尿肌括约肌协同失调、间断排尿等症状。本病起病隐袭，许多病人可多年无症状，有显著症状者大多已处于中晚期。虽然人们早已认识到了DCP的临床表现和严重危害，但是其发病机制尚未被阐明，因此临床治疗缺乏针对性，疗效不佳［1］。近年来，人们对DCP发病机制的研究有了较大进展，主要表现在以下几个方面：（1）膀胱感觉功能损害。这是早期DCP功能障碍的发病机制之一，它触发了膀胱功能异常的进展，导致触发排尿反射的膀胱阈容量增大，进而逼尿肌代偿肥大，最终导致逼尿肌失代偿；（2）膀胱收缩功能障碍。其产生与胆碱能神经损害、胆碱乙酰转移酶活性下降、胆碱能M受体上调、G蛋白及信号传导异常、嘌呤能神经损害等可能有关［2］；（3）除了神经源性病变以外，逼尿肌自身肌源性功能异常也是糖尿病性膀胱尿道功能障碍的致病机制。
关于逼尿肌自身肌源性功能异常的研究是近年来的研究热点。在本次研究中我们采用离体全膀胱灌注实验来反映膀胱整体的收缩功能，以期较全面客观地评价DCP时逼尿肌功能的改变情况。这是由于逼尿肌细胞在膀胱壁的分布呈三维立体分布，不同层面的肌纤维相互交错排列，任何一个切面切到的逼尿肌条都难以得到完整的逼尿肌细胞［3］，因此采用离体全膀胱进行实验才能比较全面反映膀胱逼尿肌整体的功能。本次离体全膀胱灌注实验显示糖尿病组大鼠膀胱逼尿肌收缩力在糖尿病早期高于正常对照组，但是随着糖尿病病程进展，逐渐转变成低于正常对照组。这一结果与在临床工作中观察到的糖尿病膀胱患者的临床表现演变过程相一致。 在本次RT-PCR法检测M3受体mRNA表达水平以及Western blot法检测M3受体蛋白的含量的实验中显示，与正常对照组相比糖尿病组大鼠膀胱的M3受体mRNA及其受体蛋白含量的表达在糖尿病早期增高了，但是随着糖尿病病程的进展，逐渐演变为低于正常对照组。这一现象与糖尿病组大鼠膀胱逼尿肌收缩力演变趋势相一致，可以解释糖尿病组大鼠膀胱逼尿肌收缩力演变情况。
膀胱逼尿肌的收缩功能主要是由胆碱能M受体介导的，逼尿肌上主要有M2及M3两种受体亚型分布，M2受体是通过抑制逼尿肌舒张而间接地介导逼尿肌收缩的［4］，直接介导收缩的是M3受体亚型，它与G蛋白偶联，通过一系列蛋白酶的激活及钙通道的开放，引起收缩过程［5］。临床上，糖尿病性膀胱功能障碍可以表现为逼尿肌活动低下或逼尿肌过度活动［6］。有学者研究发现STZ诱导造模的糖尿病大鼠膀胱M2受体的生物合成比正常大鼠显著增多，由于M2受体是通过抑制逼尿肌舒张而间接地介导逼尿肌收缩的［4］，因此推断M2受体上调通过减弱维持储尿期膀胱稳定性的逼尿肌舒张机制从而导致膀胱过度活动［7］。本次研究结果显示糖尿病早期大鼠膀胱逼尿肌收缩功能和M3受体蛋白含量及M3受体mRNA的含量三者比正常大鼠增高了，考虑原因可能是副交感神经功能低下，在导致逼尿肌活动低下同时也会导致突触后M3受体代偿性上调以维持逼尿肌收缩功能。但是随着糖尿病病程的进展膀胱逼尿肌收缩功能和M3受体蛋白含量及M3受体mRNA的含量三者却都比正常大鼠降低了，考虑原因可能是逼尿肌失代偿的表现。由此可见在糖尿病膀胱病变的早期,逼尿肌通过M3受体生物合成增加,暂时代偿甚至增强了膀胱的收缩功能,但随着糖尿病病程进展, M3受体生物合成却减少了，因此膀胱收缩功能失代偿成为无法避免后果。临床上针对DCP的治疗除控制血糖、预防与控制感染、排尿训练与导尿等一般措施外，有人用西沙必利、抗胆碱酯酶药以及前列腺素E2进行药物治疗也取得了较好的疗效。西沙必利通过对5－HT3受体的拮抗和对5－HT4受体的激动来促使乙酰胆碱的生理释放，间接增加胆碱能神经递质传递，从而促进逼尿肌收缩改善逼尿肌无力而利于排尿。抗胆碱酯酶药物能提高胆碱能神经元突触间隙中乙酰胆碱浓度从而使逼尿肌活动增强。前列腺素E2也能促进逼尿肌收缩从而改善排尿。本次研究的结果显示用STZ造模的糖尿病大鼠膀胱的M3受体的生物合成也上调了，因此可以解释长期以来观察到的毒蕈碱类胆碱药物刺激糖尿病性膀胱平滑肌后收缩力增加的现象。
【参考文献】
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7 Tong YC, Chin WT, Cheng JT.Alteration in M2-muscarinic receptor protein and mRNA in diabetic rat urinary bladders. Neurosci Lett，1999，277:173-176.
作者单位： 038500 山西朔州,朔州市消防支队卫生所
(编辑：宋 青)