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【摘要】 目的 探讨去甲硫氨酸（Met）环境是否提高化疗药物对胃癌细胞的杀伤作用。方法 将30例新鲜人胃癌组织制成单细胞悬液，分别培养于Met-Hcy+和Met+Hcy-培养基中，并在不同培养基中分别加入5-FU、DDP化疗药物，用MTT比色法检测各组细胞的抑制程度。结果 Met-Hcy+培养基分别与5-FU、DDP联合时，可显著提高化疗药物对胃癌细胞的杀伤作用。结论 Met-Hcy+培养基联合各化疗药物，可提高对胃癌细胞的杀伤作用。
【关键词】 甲硫氨酸依赖；胃癌原代细胞；化疗
The effect of methionine deprivation with chemotherapy to human primary gastric cancer cells
ZHOU Lin-bin,LI Yun-wu,XU Ning,et al.
Department of Surgery,Shanghai Ninth Hospital,Shanghai 200011,China
【Abstract】 Objective To study the effect of methionine dependence in combination with chemotherapeutical agents on human primary gastric cancer cells.Methods 30 fresh gastric cancer samples were managed to single cell suspensions and then were cultured in Met-Hcy+ and Met+Hcy- medium separately,then 5-FU,DDP were added,the inhibition rate of tumor cells in different culture media was examined by microcytotoxicity(MTT) assay.Results Methionine dependence in combination with chemotherapy enhanced obviously the killing capacity of each chemotherapeutical agents on human primary gastric cancer cells.Conclusion The combined application of Met-Hcy+ medium and different chemotherapeutical agents could enhance the antitumor effect of chemotherapy on human primary gastric cancer cells.
【Key words】 methionine dependence;primary gastric cancer cells;chemotherapy
近年来的研究发现，某些肿瘤细胞在用甲硫氨酸（Methionine,Met)前体——同型半胱氨酸替代Met的培养基中生长受阻，而正常细胞生长良好，提示肿瘤细胞的生长具有依赖Met的特性［1］。当Met依赖性的肿瘤细胞处于Met饥饿状态时，再加上周期特异性化疗药物，可望获得较好的抑制肿瘤细胞增殖的效果。本研究将人胃癌原代细胞置于Met-Hcy+和Met+Hcy-培养基中，并在不同培养基中分别加入5-FU、DDP化疗药物，观察胃癌细胞的存活率和判断去甲硫氨酸（Met）环境能否提高化疗药物对胃癌细胞的杀伤作用。
1 资料与方法
1.1 一般资料 人胃癌原代细胞取自入住本院外科的进展期胃癌病人的胃癌组织，共30例，其中腺癌28例，黏液癌2例。
1.2 细胞培养和MTT测试
1.2.1 标本采取和制备 手术时，胃癌标本一经离断，立即在无菌操作下采取胃癌组织，用机械法制成单细胞悬液，调整细胞浓度为2×105/ml。
1.2.2 培养基 以不含Met的RPMI-1640培养液（GIBCO公司）和已透析小牛血清（GIBCO公司）为基础，配制成不含Met但含有同型半胱氨酸（Hcy）的Met-Hcy+培养液和含Met但不含Hcy的Met+Hcy-培养液，见表1。
表1 Met-Hcy+培养基和Met+Hcy-培养基的补充成分 (略）
1.2.3 化疗药物溶液配制 分别以Met-Hcy+培养基和Met+Hcy-培养基为基础配制5-FU和DDP药物溶液，其中，5-FU溶液的浓度为20μg/ml，DDP溶液的浓度为6μg/ml,均为与细胞接触的终浓度的2倍。
1.2.4 接种 将每例胃癌原代细胞接种于96孔板上，100μl/孔。再分别加入以Met-Hcy+培养液和Met+Hcy-培养液为基础、分别含有5-FU（20μg/ml）、DDP（6μg/ml)的溶液，100μl/孔，使每孔总液量达到200μl。与细胞接触的5-FU终浓度为10μg/ml（10μg/ml为体内血峰浓度)；DDP终浓度为3μg/ml（3μg/ml为体内血峰浓度)。每种药物组设3个复孔。不加化疗药物组为对照组。
1.2.5 培养 将各组细胞置于37℃、含5%CO2的细胞培养箱中，培养48h后，每孔加5mg/ml四唑蓝（Tetrazolium Salt)2μl，4h后，加入10%酸化十二烷基硫酸钠溶液（含10%异丁醇）100μl，培养过夜。
1.2.6 MTT法测试 用自动酶标仪（318—Microplate Reader)比色，波长492nm，得到每孔的光密度值（OD），每组取3孔的平均值，表示该组活细胞的数量。
1.3 统计学方法 用配对t检验比较同一药物、同一肿瘤细胞在不同培养基中生长的受抑程度。以P<0.05为差异有显著性。
2 结果
不同培养基联合化疗药物对人胃癌原代细胞生长的影响。5-FU、DDP分别加入Met-Hcy+培养基和Met+Hcy-培养基后，上述化疗药物中的无论哪一种加入Met-Hcy+后，其对胃癌细胞生长的抑制作用都较加入Met+Hcy-的各组为显著（P<0.05），表现为胃癌活细胞数不同程度减少，OD值降低，见表2。
表2 化疗药物联合不同培养液对胃癌细胞的生长影响 （略）
3 讨论
化疗在恶性肿瘤治疗过程中具有不可替代的地位。化疗成功与否，对病人的生存期和生活质量具有重要影响。胃肠道肿瘤多属化疗中等敏感的恶性肿瘤，目前临床应用的经验性化疗方案缓解率仅为30%左右，大多仅能达部分缓解，而且由于肿瘤细胞异质性及多重耐药性等因素存在，使化疗效果并不理想。通过抗肿瘤药物敏感性检测，前瞻性地提出个体化化疗方案，以指导临床治疗，对提高疗效、避免不必要的毒副作用及防止肿瘤多重耐药性的发生有重要意义。
自1974年Timofeyresky在光学显微镜下观察抗癌药物对白血病细胞形态的影响以来，化疗药物敏感性检测得到了迅速发展。1971年，Park首创人肿瘤细胞集落形成药敏测试法（HTCA法），随后，其他学者又相互建立了同位素渗入法（3H-TdR法）、四唑蓝快速比色法（MTT法）、区别染色细胞毒法（Disc法）、三磷酸腺苷生物法（TAP-CSA法）和琥珀酸脱氢酶抑制试验（SDI-T法）等。MTT法利用活细胞线粒体脱氢酶能将可溶性MTT转化为蓝色衍生物亚臜（formazan)的原理，通过自动酶标仪计数来检测活细胞数量，从而评价肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。
当前临床上常规使用的化疗药物，还难以完全杀灭肿瘤细胞，采用某些措施进一步提高化疗药物疗效，是抗肿瘤治疗的目标之一。从理论上说，细胞群体中处于增殖期的细胞越多，则该群体受细胞周期特异性化疗药物的作用越大。因此，促使G0期肿瘤细胞进入增值周期是提高肿瘤化疗疗效的一种新的尝试途径。甲硫氨酸（Met)是一种含硫氨基酸，系S-腺苷甲硫氨酸的前体，后者是甲基易位时的主要提供者，各种恶性肿瘤细胞在缺乏Met时，其代谢和增殖均受到抑制。国内外多年的研究表明［1］，Met饥饿可使大部分肿瘤细胞停滞于S期和G2M期，这就为临床上应用Met饥饿+周期特异性化疗，更有效地提高化疗药物疗效提供了一条新途径。
众多学者研究证实［2，3］，将Met--TPN分别与5-FU、DDP等药物连用时，能显著提高胃癌、乳癌等肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。本研究结果表明：5-FU、DDP与Met-Hcy+培养基连用，对胃癌细胞生长的抑制作用较其与Met+Hcy-连用时显著（P<0.05），可提高化疗药物对胃癌细胞的杀伤作用，再次证实上述效果。推测其原因，可能系Met-Hcy+培养基能够造成肿瘤细胞的“Met饥饿”，影响蛋白质、核酸代谢，使肿瘤细胞的增值期细胞比例增多，在此阶段有针对性地使用周期特异性化疗药物，Met-Hcy+培养基可起到化疗增效剂的作用［4］，将更有效地杀伤肿瘤细胞。
Met-Hcy+培养基联合应用化疗药物5-FU、DDP，可提高对胃癌细胞的杀伤作用，为提高肿瘤化疗疗效提供了一种新的途径。
【参考文献】
1 Guo HY,Herrera H, Groce A, et al.Expression of the biochemical defect of methionine dependence in fresh patient tumors in primary histoculture.Cancer Res,1993,53:2479.
2 Hoshiya Y,Kubota T, Matsuzaki SW, et al. Methionine starvation modulates the efficacy of cisplatin on human breast cancer in nude mice.Anticancer Res,1996,16(6B):3515-3517.
3 曹伟新，徐宁，尹浩然，等.肿瘤细胞的硫氨基酸依赖性对肿瘤化疗的作用.中华实验外科杂志,1999,16(4):319-320.
4 欧敬民,曹伟新,朱正纲,等.去甲硫氨酸环境加化疗药物对人胃癌原代细胞生长的阻抑.肠外与肠内营养,2001,8(2):80-83.
(编辑：丁剑辉)
作者单位： 200011 上海，上海第二医科大学附属第九人民医院外科（△临床药理室）