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【摘要】 目的 探讨Survivin反义核酸技术诱导乳腺癌细胞凋亡的作用及效果。方法 本实验共分6组，分为以脂质体介导反义寡核苷酸组（ASODN/Lip）、无义寡核苷酸组（NODN/Lip）及RPMI 1640培养液的空白对照组（Lip），转染人乳腺癌MCF-7细胞系，应用Hoechst 33258/PI双重染色观察MCF-7细胞的形态学改变，透射电镜观察细胞超微结构，流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡的变化，DNA凝胶电泳观察凋亡情况，研究Survivin反义寡核苷酸对MCF-7乳腺癌细胞的生长抑制作用。结果 Hoechst 33258/PI染色及透射电镜观察可见转染后的细胞结构呈凋亡样改变；流式细胞仪检测见转染后细胞凋亡显著增加，并出现G2/M期阻滞现象；DNA凝胶电泳在600ng/ml，800ng/ml ASODN/Lip组的电泳图谱上呈现出明显的“梯状”现象。结论 凋亡抑制基因Survivin表达下调对乳腺癌细胞的生长抑制作用主要是通过诱导细胞发生凋亡以及阻止有丝分裂发生在G2/M阻滞期来实现，Survivin靶向反义核酸技术可能成为乳腺癌基因治疗的一种有效方法。
【关键词】 乳腺癌；Survivin基因；反义核酸技术；凋亡
Cells apoptosis induced by survivin antisense oligonucleotide
DUAN Ti-de,LIU De-quan, YANG Ce-yao.
Department of General Surgery,The First Affiliated Hospital of Kunming Medical College,Kunming 650032,China
【Abstract】 Objective To explore the effect of cells apoptosis on human breast cancer after survivin was blocked with the antisense technique.Methods The experiments were divided into six groups. Antisense Oligonucleotide (ASODN), nonsense oligonucleotide (NODN) was transfected in human breast cancer MCF-7 cell line and RPMI 1640 culture medium (normal control). The study used Hoechst 33258/PI,electron microscope, flow cytometer and in gel electrophoresis of DNA to observe the cells apoptosis.Results The cells apoptosis after transfection were observed by Hoechst 33258/PI,electron microscope and in gel electrophoresis of DNA.The result of flow cytometer showed the cells apoptosis after transfection and the blocking phenomena appeared in G2/M period.Conclusion The restriction by the reduction of survivin expression in breast cancer cells is mainly functioned through its induction of cells apoptosis and prevention of mitosis at G2/M period. Survivin targeting therapy can be used as an important method in breast cancer treatment.
【Key words】 breast cancer；survivin gene；antisense technique；apoptosis
现代分子生物学研究发现与细胞恶性增殖和分化受阻一样，细胞凋亡异常在大多数恶性肿瘤的发病学上亦占有重要地位。诱导肿瘤细胞发生凋亡目前正逐步成为治疗恶性肿瘤的一种重要的治疗方法，具有较高的选择性与靶向性。Survivin是近年来发现的一个新的细胞凋亡抑制基因，能够抑制肿瘤细胞凋亡，使肿瘤细胞得以生存，在肿瘤细胞内导入凋亡活化基因或灭活凋亡抑制基因是肿瘤基因治疗的主要方法。在本实验研究中我们应用荧光染色、电镜、DNA琼脂糖凝胶电泳、流式细胞仪等技术，从细胞形态学到细胞周期、DNA变化，从定性到定量进行了研究。探讨是否可通过转染Survivin反义寡核苷酸（ASODN）诱导乳腺癌MCF-7细胞发生凋亡，为乳腺癌的基因治疗提供理论实验依据。
1 材料与方法
1.1 细胞培养 MCF-7人乳腺癌细胞株由中国科学院上海细胞研究所提供。将加入含10%小牛血清的RPMI 1640培养液制成的细胞悬液，镜下计数，调节细胞至约1×106个/ml，分别接种于30ml培养瓶、96孔培养板及铺有盖玻片的6孔培养板，37℃，5%CO2常规培养至80%汇片后进行转染。
1.2 脂质体介导Survivin ASODN转染MCF-7细胞
1.2.1 寡核苷酸的设计及合成 采用Survivin mRNA 231-251设计互补ASODN，反义寡核苷酸（ASODN）序列5′CCCAGCCTTCCAGCTCCTTG3′；对照无义寡核苷酸（NODN）序列5′CGCAGTAGCTGCGCTGATTG3′，对照序列经GeneBank比对无相关基因，两条序列每端5个磷酸基采用硫代磷酸型，即在合成时用硫基取代寡核苷酸片段磷酸上的羟基，部分反义寡核苷酸5FAM荧光素标记，由上海生物工程公司提供。
1.2.2 转染混合物的制备及配制 A液：Survivin反义寡核苷酸及对照序列的浓度设定为：200，400，800，1200，1600（ng/ml），用不含血清及抗生素的RPMI 1640将反义寡核苷酸配成上述浓度溶液。B液：将Lipofectin：RPMI 1640（不含血清及抗生素）=4μl∶100μl的比例配成B液。将等体积的A液与B液混合，室温下放置40min左右，使脂质体与寡核苷酸充分包裹。寡核苷酸的终浓度为100，200，400，600，800（ng/ml）。
1.2.3 转染 将不同浓度的ASODN-RPMI 1640转染混合物加入培养瓶或培养板中。本实验设6组分别为：（1）Lip组以RPMI 1640培养液代替转染混合物作为空白对照（加入Lip）；（2）无义对照（NODN）组，以NODN/Lip-RPMI 1640转染细胞作为无义对照；（3）200ng/ml ASODN转染组；（4）400ng/ml ASODN转染组；（5）600ng/ml ASODN转染组；（6）800ng/ml ASODN转染组，37℃，5%CO2常规培养24h，弃去转染混合物，胰酶消化收集细胞。96孔板中的细胞用于检测细胞贴壁率、细胞生长抑制率以及绘制细胞生长曲线。
1.3 透射电镜观察MCF-7细胞超微结构 转染接种于30ml培养瓶的细胞48h，以0.25%胰蛋白酶/0.02EDTA消化，戊二醛原位固定，琼脂包埋沉淀细胞，梯度丙酮系列脱水，Epon812系列包埋固定，超薄切片用醋酸铀及柠檬酸铅染色，电镜下观察、拍照。
1.4 Hoechst 33258与PI染色细胞形态学观察 荧光显微镜下观察细胞核形态及颜色改变以区分出天然细胞、凋亡细胞以及坏死细胞。
1.5 流式细胞仪检测细胞凋亡率和细胞周期 细胞转染结束后培养48h，每组收集2×106个细胞，预冷的70%乙醇4℃固定24h，PBS洗涤3次，细胞重悬于0.4ml PBS中，加入10.15mg/m1的PnaseA 37℃孵育1h，1g/ml PI 4℃染色过夜，流式细胞仪检测凋亡细胞的比率和细胞周期。资料经ModFit软件分析。
1.6 DNA抽提及电泳
1.6.1 进行凋亡细胞DNA抽提 收集2×106个/ml的实验组和对照组细胞，200g离心洗涤后，按凋亡DNA提取试剂盒说明书进行实验。收取DNA，弃去无水乙醇后，用70%乙醇混匀漂洗3次，开盖室温放置15min让乙醇挥发，加入含1mmol EDTA，10mmol Tris-HCl（pH 7.8）TE缓冲液，使DNA溶解，4℃冰箱保存备用。
1.6.2 DNA琼脂糖凝胶电泳 取10μl提取的DNA样品（含1mg DNA量）与0.25%溴酚蓝和40%蔗糖溶液混匀后，加入琼脂糖凝胶样品槽内，在由1mmol/L EDTA（pH 8.0）和45mmol/L Tris-硼酸缓冲液配制的内含0.5μg/ml溴乙啶染料的1.5%琼脂糖凝胶中电泳，电压稳定在50V，电泳1.5h后，取出标本在紫外灯下观察DNA阶梯状条带形成，结果用紫外透射仪观察，拍照。
1.7 统计学方法 本实验数据资料以均数±标准差（χ±s）表示，应用SPSS 11.0软件包进行方差分析，显著性水准为α=0.05。
2 结果
2.1 细胞形态学观察 处理后的MCF-7细胞经Hoechst 33528/PI双重染色后，表现为细胞体积缩小，细胞完整、细胞膜皱缩、染色质浓缩边聚呈新月形、细胞核固缩与断裂、核仁消失，在细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒状荧光的即为早期凋亡细胞（见图1， 2）。
2.2 DNA电泳结果 本实验结果显示，600ng/ml，800ng/ml ASODN在Lip介导下处理MCF-7细胞48h后，在琼脂糖凝胶电泳图谱上呈现出明显的“梯状”现象（见图3），推论ASODN在Lip介导下能诱导MCF-7细胞凋亡。
M：marker 1～6道分别为Lip组，NODN/Lip组，（200、400、600、800）ng/ml ASODN/Lip组处理
图3 MCF-7细胞48h后凋亡DNA凝胶电泳图谱（略）
2.3 流式细胞仪分析转染前后细胞周期的变化 细胞周期分析可见转染后各组G1期细胞分别为72.62%，68.26%，62.38%，54.65%，12.98%及7.01%，各转染组G1期细胞显著减少；S期细胞无明显变化；转染后各组G2/M期细胞分别为5.83%，4.98%，7.12%，12.28%，40.18%及43.82%，各转染组G2/M期细胞显著增加，出现G2/M期阻滞现象。说明Survivin ASODN能够以剂量依赖的方式诱导乳癌细胞发生G2/M期阻滞，随着ASODN的浓度增加，凋亡峰值增大，200ng/ml组凋亡峰值为（2.38±0.10）%；当浓度达到800ng/ml时，凋亡峰值为（30.16±1.68）%，与此同时G2/M期细胞所占的比例随之增加；经统计分析ASODN组不同浓度间差异有显著性（P<0.05），与Lip组和NODN/Lip组比较差异有显著性（P<0.05），这种差异均见于G1期、S期、G2/M期（见表1，图4）。
表1 转染24h后细胞周期变化（略）
注：与Lip组比较，*P<0.01；与NODN/Lip组比较，△P<0.01
图4 流式细胞仪检测转染Survivin ASODN前后凋亡峰及细胞周期的变化图（略）
2.4 透射电镜观察 经反义核酸作用后48h，在600ng/ml ASODN/Lip组浓度作用发现大量的凋亡细胞，表现为细胞核边聚、核浓缩、核碎裂等（见图5，6）。
图5 透射电镜（×3000）示凋亡细胞，染色质凝集成团块状部分并附着在核膜上（略）
图6 透射电镜（×3000）示凋亡细胞染色质边聚，形成新月状（略）
3 讨论
基因治疗是恶性肿瘤的最新治疗手段，随着对细胞凋亡调控异常在肿瘤发病学中的重要性的认识，在肿瘤细胞内导入凋亡活化基因或灭活凋亡抑制基因已经构成肿瘤基因治疗中最诱人的策略之一。Survivin基因是1997年新近发现的一种凋亡抑制基因，在肿瘤的发生、发展的病理过程中，能抑制肿瘤细胞的凋亡使肿瘤细胞得以生存。它能够广泛表达于人体胚胎组织和多种恶性肿瘤组织，而在正常组织中几乎不表达。尤其是作为一种广谱表达的肿瘤特异性凋亡抑制因子，抑制Survivin的表达将可能成为肿瘤靶基因蛋白治疗的理想靶点。对于Survivin以何种机制抑制凋亡众多研究认为［1］ Survivin可通过直接抑制凋亡信号转导过程中最下游的效应分子Caspase-3的活性而阻断细胞凋亡的发生过程。
近来研究发现，肿瘤是一类细胞增殖周期紊乱性疾病，即细胞凋亡失控的疾病，细胞周期的调控在肿瘤的发生和治疗中起重要作用［2］。在细胞周期的G1期及G2/M期存在检验点调控（checkpoint control），其功能是在细胞进行有丝分裂时控制有丝分裂器的装配，维持细胞倍性，保持细胞分裂的同步，从而保证细胞周期在上游事件正确完成的前提下才启动下游事件［3］。本实验发现，Survivin的表达对促进乳腺癌细胞完成有丝分裂具有重要作用，采用Survivin ASODN转染乳腺癌细胞后，出现了G2/M期阻滞现象，表现为转染后G2/M期细胞较对照组显著增加，而G1期细胞减少。且随着Survivin ASODN浓度的增加，转染后G2/M期细胞逐步增加而G1期细胞迅速减少。由于Survivin仅特异地表达于细胞周期的G2/M期，因此可以推测Survivin基因对于细胞顺利地通过G2/M期检验点，促进细胞周期从G1期向S期变化，从这个意义上也可以认为Survivin是一种G2/M检验点调控相关基因。封闭Survivin的表达可以诱导乳腺癌细胞的生长停滞于G2/M期，使之无法完成有丝分裂，从而抑制乳腺癌细胞的增殖活性促进其发生凋亡。
细胞周期阻滞以及检验点调控可以通过诱导细胞凋亡来清除损伤的细胞，阻断细胞增殖周期进程可以引起凋亡，细胞增殖周期与凋亡密切相关，而凋亡也常伴有细胞生长阻滞［4］。研究发现，Survivin主要定位于有丝分裂末期的中体，Survivin表达的下调使细胞纺锤体能够延长，但不能完成有丝分裂，从而导致多核细胞的蓄积，其功能类似于C.elegan的BIR-1蛋白［5］。本实验发现经Survivin ASODN转染后阻断乳腺癌MCF-7细胞Survivin的表达可以导致MCF-7细胞阻滞于G2/M期并发生凋亡，提示Survivin在肿瘤细胞分裂的调控中发挥了重要作用，这一结果与Survivin特异性地表达于细胞周期的G2/M期以及其在纺锤体的定位等特性也是一致的。因此可以认为Survivin ASODN转染后乳腺癌细胞发生G2/M期阻滞除了可以阻止乳腺癌细胞完成有丝分裂，抑制其增殖活性以外，更重要的是可以通过阻断细胞周期的进程诱导乳腺癌细胞发生凋亡。Survivin在G2/M期的选择性表达决定了其表达被ASODN封闭后细胞发生在G2/M期阻滞并发生凋亡。
本实验通过DNA电泳发现Survivin ASODN/Lip在400ng/ml作用48h后可检测出特异性凋亡带，终浓度为600ng/ml，800ng/ml时较明显。凋亡细胞的生化改变关键点是DNA链被核酸内切酶从核小体处切断形成大约180~200bp整数倍的DNA片段，用琼脂糖凝胶电泳检测，表现为DNA梯形构型或条纹，说明ASODN在Lip倡导下能诱导MCF-7细胞发生凋亡。利用流式细胞仪测量DNA含量时即可辨别凋亡细胞，其特点是在正常细胞周期前出现一个不连续性亚二倍体峰（或凋亡峰），凋亡峰的出现及其大小是流式细胞仪定量分析DNA断裂的一个重要指标，较琼脂糖凝胶电泳检测具有更高的灵敏性且能精确定量区分早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞与死亡细胞。本实验通过流式细胞仪检测不同浓度ASODN/Lip转染组凋亡峰值较Lip、NODN/Lip组明显上升（P<0.05）。实验发现经600ng/ml Survivin ASODN/Lip处理后的MCF-7细胞经Hoechst 33258/PI双重染色后，在荧光显微镜下经紫外光激发可观察到细胞肿胀、体积增大、外形不规则、细胞膜皱缩、染色质浓缩边聚呈新月形、细胞核固缩与断裂、核仁消失等细胞形态学改变，在细胞核或细胞质内可见到有浓染致密的颗粒状荧光的早期凋亡细胞及被染成红色荧光的坏死细胞。通过电镜下观察Survivin ASODN/Lip在400ng/ml作用48h后发现大量的凋亡细胞，表现为MCF-7细胞出现较多的致密的凋亡小体，并出现细胞核浓缩、核聚集、核碎裂、核边聚集等。在ASODN/Lip 600ng/ml及800ng/ml组则可观察到更多的细胞凋亡形态学改变，而在Lip组及NODN/Lip组细胞超微结构未发现明显的凋亡细胞形态学改变。肿瘤的反义基因治疗是应用反义核酸在转录和翻译水平阻断某些异常基因的表达，以阻断瘤细胞内的异常信号传导，使瘤细胞进入正常分化轨道或引起细胞凋亡的一种治疗手段。因此反义寡核苷酸封闭凋亡抑制基因Survivin可能成为一种有效的治疗肿瘤的措施，为今后乳腺癌的综合治疗以及联合其他基因的治疗提供了一种有效的途径。
（本文图1，图2见封三）（略）
【参考文献】
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2 Hartwell LH, Kastan MB. Cell cycle control and cancer. Science,1994,266(5192):1821-1828.
3 Hartwell LH, Weinert TA. Checkpoints control that ensure the order of cell cycle events. Science,1989,246(4930): 629-634.
4 Chiarugi M，Magnelli L, Cinelli M, et al. Apoptosis and the cell cycle. Cellular Mol Biol Res,1994,40(7-8): 603-612.
5 Chen J, Wu W, Tahir SK, et al. Down-regulation of survivin by antisense nliunnucleotides increases anontosis inhibits cytokinesis and anchorage-independent growth. Neoplasia,2000,2(3): 235-241.
(编辑：朱兆耘)
作者单位： 650032 云南昆明，昆明医学院第一附属医院
650106 云南昆明，昆明医学院第三附属医院