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【摘要】 目的 探讨抗凋亡基因bag-1和bcl-2在乳腺癌组织中的表达及意义，了解肿瘤细胞凋亡的特点。方法 采用免疫组化SABC法观察了100例乳腺癌与10例乳腺良性肿瘤及10例正常乳腺组织的石蜡标本切片中bag-1和bcl-2 的表达，并进行统计研究。结果 Bag-1在乳腺癌组织、乳腺良性肿瘤中，正常乳腺组织中阳性表达率分别为85.0%、10.0%、10.0%，差异有显著性（P<0.05）,其表达与不同病理类型及临床分期无关（P>0.05）。bcl-2在乳腺癌组织、乳腺良性肿瘤、正常乳腺组织中阳性表达率分别为46.0%、80.0%、90.0%，差异有显著性（P<0.05）。其表达与不同病理类型及临床分期亦无关（P>0.05）。 对100例乳腺癌进行随访，bag-1阳性表达者5年生存率为78.7%，bag-1阴性表达者5年生存率为8.5%，两者差异有显著性（P<0.05）。bcl-2阳性表达者5年生存率为43.6%，bag-1阴性表达者5年生存率为46.8%，两者差异无显著性（P>0.05）。结论 bag-1在乳腺癌组织中高表达， bcl-2在乳腺癌组织中低表达，bag-1、 bcl-2在乳腺癌组织中的表达与肿瘤的临床分期、病理分型等无关。bag-1阳性表达者预后好，而bcl-2的表达与预后无关。
【关键词】 bag-1；免疫组化；乳腺癌；细胞凋亡；预后
Expression of bag-1 and bcl-2 gene and its relationship between the genesis and prognosis of breast cancer
YUN Jun,WANG Ling,YI Jun,et al.
Department of Vascular Surgery , Xijing Hospitol,The Fourth Military Medical University,Xi an 710033，China
【Abstract】 Objective To evaluate bag-1 and bcl-2 expressions in breast cancer and to evaluate its clinical significance.Methods Bcl-2 and bag-1 expressions were studied by immunohistochemstry Streptavidin-Biotin-Peroxidase Complex (SABC) methods in 100 samples of breast cancer tissues and in 10 normal breast tissues and in 10 benign tumor tissues, and their clinical significance were analysed.Results The positive rate of bag-1 expression among breast cancer , benign tumor and normal tissues were 85.0%,10.0%,10.0% respectively,and significant difference were observed (P<0.05). However, the positive rate of bag-1 expression are not related to the pathologic grades and the different clinical type(P>0.05). The positive rate of bcl-2 expression among breast cancer , benign tumor and normal tissues were 46.0%,80.0%,90.0% respectively,and significant difference were observed (P<0.05). The positive rate of bcl-2 expression is not related to the pathologic grades and the different clinical type (P>0.05).Following up the 100 breast cancer patients,we know that 5-year survival rate of bag-1 positive is 78.7%,and the negatives is 8.5%,significant difference were observed (P<0.05). 5-year survival rate of bcl-2 positive is 43.6%,and the negatives is 46.8%,no significant difference is observed (P>0.05).Conclusion There is an overexpression of bag-1 and lower expression of bcl-2 in breast cancer. The positive rates of bcl-2 and bag-1 expression are not related to the pathologic grades and the different clinical type . The overexpression of bag-1 may be related to a longer survival time and a higher survival rate. The positive rate of bcl-2 is not related to the prognosis of breast cancer.
【Key words】 bag-1; immunohistochemistry; breast cancer ;apoptosis; prognosis
乳腺癌是影响妇女最常见的恶性肿瘤，大量研究表明癌基因的激活、抑癌基因的失活、生长因子受体的激活等在其发生、发展中具有重要意义、凋亡障碍及其机制是肿瘤学研究的一个热点。研究这些基因在肿瘤中的表达及相互作用，对于揭示肿瘤发生、发展的机制有着十分重要的意义。bag-1是一种已经被确认的多功能结合蛋白，它具有与bcl-2形成复合物，而促进抗细胞凋亡的能力［1］。笔者采用免疫组化染色方法观察了100例乳腺癌中bag-1与bcl-2的表达情况并就其意义进行了初步讨论。
1 材料与方法
1.1 标本来源 收集1995年5月～2000年5月手术切除的乳腺癌石蜡包埋组织块100例，均来自我院病理科存档标本，标本均经过40g/L多聚甲醛灌注固定，常规石蜡包埋连续切片，厚约4μm，标本供者年龄32～67岁，平均47.1岁。其中导管癌62例，小叶癌33例，特殊型癌5例。按UICC TNM分期：Ⅰ期32例，Ⅱ期51例，Ⅲ期17例。同时选择10例乳腺良性肿瘤和10例正常乳腺组织石蜡标本作为对照。
1.2 试剂 兔抗人bag-1抗体由加拿大Dr. H. Bliss Murphy癌症中心赠送，SABC免疫试剂盒及兔抗人bcl-2抗体购自武汉博士德公司。抗bcl-2及抗bag-1抗体的工作浓度1∶50，生物素化单抗和SABC试剂的工作浓度均为1∶100。
1.3 方法 参照SABC说明书进行。（1） 石蜡组织切片常规二甲苯脱蜡，系列酒精处理后充分水洗。（2） 9g/L 甲醇-过氧化氢室温孵育5min,PBS（pH 0.01）洗5min重复3次。（3）3g/L胰蛋白酶溶液，37℃消化30min。PBS洗5min重复3次。（4）1∶50正常羊血清封闭20min。（5）加入PBS稀释的一抗，37℃温育2h ，PBS洗5min重复3次。（6）1∶100稀释生物素化二抗37℃温育60min，PBS洗5min重复3次。（7）临用前配制SABC，PBS 1ml加入A液10μl和B液10μl，混匀后加至切片。37℃温育30min，PBS洗5min重复3次。（8）DAB显色：PBS 100ml中加入DAB 25mg。加300ml/L H2O2 50μl,室温显色3min，自来水充分洗。（9）Mayor苏木精复染30s，PBS泡直至切片变蓝，自来水充分洗。（10）蒸馏水洗2min重复3次。常规脱水，透明，中性树胶封片。光学显微镜（Olympus BH-2）镜检。对照实验用同等稀释度的正常家兔血清及PBS替代一抗作为替代及阴性对照，其他实验步骤不变。
1.4 判定标准 在10×40倍光镜下随机观察5个视野,计算其平均数，每个视野计数100个细胞。bag-1胞浆胞核棕黄色染色为阳性染色，bag-1阳性细胞<10%为低表达（+），10%～30%为中度表达（++），>30%为高表达（+++）。bcl-2胞浆出现棕黄色染色为阳性， bcl-2染色阳性细胞<30%为低表达（+），30%～50%为中度表达（++），>50%为高表达（+++）。
1.5 统计学方法 阳性表达率比较用χ2检验；bcl-2、bag-1与预后的关系用Fisher精确概率法检验分析。
2 结果
2.1 bcl-2与bag-1在乳腺癌及正常组织中的表达
2.1.1 bag-1的表达 bag-1蛋白表达在癌细胞的胞膜、胞浆上呈棕黄色颗粒。bag-1在10例正常组织中只有1例阳性表达，阳性率为10.0%，而在乳腺癌组织中的阳性表达有85例，占85.0%,χ2检验，两者差异有显著性（P<0.05）。 比较bag-1在乳腺癌不同病理类型中的表达，在62例导管癌中，阳性53例（85.5%）；小叶癌33例中，阳性28例(84.8%)；特殊型癌5例中，阳性4例 (80.0%)。统计分析表明：3种乳腺癌中bag-1的表达率差异无显著性（χ2检验,P>0.05）。即表明bag-1的表达与乳腺癌病理分型关系不大，见表1。
2.1.2 bcl-2的表达 10例正常组织中，阳性9例，阴性1例，阳性率90.0%。阳性细胞多分布在细胞浆上，呈棕黄色颗粒。100例乳腺癌组织中，阳性46例，阴性54例，阳性率46.0%， bcl-2蛋白主要表达在癌细胞的胞浆及核膜，呈棕黄色颗粒。乳腺癌组织中bcl-2表达明显低于正常组织，χ2检验，两者差异有显著性（P<0.05）。比较bcl-2在乳腺癌不同病理类型中的表达，在62例导管癌中，阳性29例（46.8%），小叶癌33例中，阳性15例(45.5%)，特殊型癌5例中，阳性2例 (40.0%)。统计分析表明：3种乳腺癌中bcl-2的表达率差异无显著性（χ2检验, P>0.05）。即表明bcl-2的表达与乳腺癌病理分型关系不大，见表1。
表1 bcl-2、bag-1在乳腺肿瘤及正常乳腺中的阳性表达情况（略）
2.2 bcl-2与bag-1的表达与乳腺癌的临床分期的关系 本研究中Ⅰ期乳腺癌32例，Ⅱ期乳腺癌51例，Ⅲ期17例。bag-1阳性表达分别是28例（87.5%）、42例(82.4%)、15例(88.2%)。bcl-2的阳性表达分别是16例（50.0%）、22例（43.1%）、8例（47.1%）。bcl-2的阳性平均表达率进行每期之间的两两比较,χ2检验, 结果各期之间P＞0.05，表明bcl-2的表达与乳腺癌临床分期关系不大。bag-1的阳性平均表达率进行每期之间的两两比较,χ2检验, 结果各期之间P＞0.05，表明bag-1的表达与乳腺癌临床分期关系不大，见表2。
表2 bag-1及bcl-2在乳腺癌不同临床分期中的表达（略）
2.3 bcl-2与bag-1表达与预后的关系 所有病例均获随访5年以上，最长达8年，失访6例，失访率6.0%。所有病例均经过CMF方案进行化疗，100例乳腺癌中，ER(+)67例，PR(+)48例, 所有ER阳性者均行内分泌治疗（口服三苯氧胺）。按5年生存分组，术后存活≥5年的有83例，其中bag-1阳性表达者有74例，bcl-2阳性表达者有41例，分析预后与基因阳性表达的关系，Fisher精确概率法检验bag-1与乳腺癌的预后关系，结果P=0.0427<0.05，表明bag-1与乳腺癌的预后密切相关，bag-1表达阳性者5年生存率高，生存期长，预后好；Fisher精确概率法检验bcl-2与乳腺癌的预后关系，结果P=0.2092>0.05，表明bcl-2与乳腺癌的预后无关，见表3。
表3 bag-1及bcl-2在乳腺癌中的表达与预后的关系（略）
3 讨论
研究表明肿瘤细胞的凋亡受多种基因表达方式改变的影响。 bag-1基因是Takayama-S等1995年首先报道，bag-1是一种抗凋亡基因，其分泌蛋白是一种已经被确认的多功能结合蛋白。虽然bag-1不属于bcl-2家族成员，但是可以与bcl-2形成复合物，而促进抗细胞凋亡的能力［1］。bag-1可以与酪氨酸激酶生长因子受体，肝细胞生长因子受体，来自血小板生长因子受体相联结，加强它们的功能而抑制凋亡［2］。bag-1还可以与多种激素受体相结合，如雌激素受体、雄激素受体、糖皮质激素受体等，而调整它们的功能［3］。bag-1在正常组织中几乎不表达，而在乳腺癌、肺癌、前列腺癌、胃癌、肾癌及甲状腺癌中都有阳性表达［4～8］ 的报道。Tang SC等［9］在对143例浸润型乳腺癌的研究中发现，76.9%病例bag-1蛋白表达阳性，正常对照组无一例阳性，该结果证明bag-1具有抗凋亡作用，而且bag-1蛋白阳性表达与肿瘤的恶性程度有关，恶性程度越高，bag-1蛋白阳性表达率也越高。也有学者报道，bag-1蛋白阳性表达与肿瘤的恶性程度无关［10，11］。Yang X等［12］在对乳腺癌的研究中发现，bag-1蛋白阳性表达与预后明显相关（P=0.0033），但bag-1蛋白阳性表达与肿瘤的分级无关。Turner［13］等对122例乳腺癌患者研究，进行12.1年随访，发现bag-1水平愈高，生存时间愈长，bag-1过度表达者，10年生存率为82%，bag-1低表达者，10年生存率为42%。一些研究结果认为bag-1在乳腺癌中阳性表达率较高，且与分期、分级及预后密切相关［9，13］。
本实验结果表明，在乳腺癌组织中bag-1的阳性表达率比乳腺良性肿瘤和正常乳腺中高，而乳腺良性肿瘤中，正常乳腺中bag-1的阳性表达率没有显著差异。由于bag-1在正常组织中几乎不表达，而在乳腺癌中bag-1的阳性表达率达85%，说明bag-1与乳腺癌的发生密切相关，故其可作为乳腺组织癌变的早期诊断的指标，在不同乳腺癌中， bag-1的表达率没有显著差异，即表明bag-1的表达与乳腺癌病理分型关系不大。不同临床分期中bag-1的表达率亦没有显著差异，即表明bag-1的表达与乳腺癌临床分期关系不大，说明bag-1与乳腺癌的发展关系不大，它可能没有参与乳腺癌的恶性分化过程。根据随访结果分析预后与bag-1基因阳性表达的关系，Fisher精确概率法检验，P<0.05，表明bag-1与乳腺癌预后密切相关，bag-1表达阳性者5年生存率高。这和Turner［13］等对122例乳腺癌患者研究得出的结论一样。近年，在乳腺癌的研究中，发现bag-1可与激素受体结合从而降低激素药物对激素依赖性肿瘤的治疗作用［7, 9］。故推测bag-1在肿瘤的发生发展及逃避细胞凋亡过程中的作用是多方面的。
bcl-2是较为肯定的一种抗凋亡基因。它是于20世纪80年代初发现于造血系统肿瘤的一个原癌基因，该蛋白是一种GTP连接蛋白，在生长因子受体介导的信号传导途径中起作用。bcl-2主要通过抑制细胞凋亡而参与肿瘤的发病，同时，一些研究也认为bcl-2的表达是一些肿瘤产生耐药的机制之一，bcl-2蛋白主要分布在核膜外层、内质网及线粒体外膜上。在乳腺癌、胃癌、直肠癌等多种肿瘤的研究中，bcl-2与肿瘤的分级、分期有关［14］。关于bcl-2与乳腺癌预后的关系目前还没有定论。近年来，有学者指出，bcl-2的过表达是一个可靠的临床预后指标。有学者提出bcl-2蛋白的表达抑制凋亡的发生，bcl-2高表达，凋亡率低者预后好，但是也有学者认为bcl-2低表达，凋亡率高者预后好，或与预后无关［15］。Gee等提出bcl-2蛋白是由雌激素调节的，此蛋白多局限在那些拥有ER的乳腺癌细胞中，这是内分泌治疗的必要条件。因此bcl-2高表达者预后好可能是由于其对激素治疗反应好所致［16］。
本研究发现，乳腺癌组织中bcl-2表达明显低于正常组织，但bcl-2的表达与乳腺癌病理分型、临床分期关系不大。推测，bcl-2可能参与了乳腺组织由良性向恶性转化的过程，但与恶性分化可能无关。bcl-2在绝大多数正常乳腺组织高表达，而在乳腺癌中其表达下调，这提示bcl-2的失表达可能反映细胞的去分化，乳腺癌的发生过程中bcl-2表达下降的机制目前还不清楚，可能的解释是bcl-2下调诱导癌细胞凋亡以维持细胞数量的增加，保持肿瘤生长与凋亡间的平衡。由以上我们推测，bcl-2在乳腺癌的发生中可能有一定的作用，它可能参与了乳腺癌的发生过程，对乳腺癌的发生过程中凋亡的调控起重要的作用。本实验中， bcl-2表达阳性者有41例，分析bcl-2基因阳性表达率与乳腺癌预后的关系，Fisher精确概率法检验：P=0.2092，P>0.05，表明bcl-2与乳腺癌的预后无关。这和Holmqvist P的报道一致［15］。
综上所述，bag-1在乳腺癌组织中高表达， bcl-2在乳腺癌组织中低表达，bag-1、 bcl-2在乳腺癌组织中的表达与肿瘤的临床分期、病理分型等无关。bag-1阳性表达者预后好，而bcl-2的表达与预后无关。
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(编辑：夏 琳)
作者单位： 710033 陕西西安，第四军医大学西京医院血管内分泌外科（△通讯作者）