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【摘要】 目的 研究化疗药物对胆囊细胞的敏感性。方法 应用MTT法及流式细胞仪，选择6种化疗药物作用于胆囊癌细胞株，进行化疗药物敏感性的检测。结果 MTT法及流式细胞法测定6种化疗药物对胆囊癌细胞的敏感性，由高至低依次为顺铂(DDP)34.77±3.53、丝裂霉素(MMC)33.25±3.40、卡铂(CDB)15.73±4.50、阿霉素(ADM)15.52±3.56、甲氨蝶呤(MTX)14.5±2.13、长春新碱(VCR)8.5±1.95。结论 6种化疗药物以DDP、MMC较敏感，CDB、ADM、MTX次之，VCR最差。
【关键词】 胆囊癌；化疗；流式细胞仪
The sensitivity of the primary gallbladder carcinoma to chemotherapeutic drugs
ZHOU Cheng,HU Si-an,GONG Zhao,et al.
Minimally Invasive Surgery Center,The First Hospital of Wuhan, Wuhan 430022,China
【Abstract】 Objective To study the sensitivity of the primary gallbladder carcinoma to chemotherapeutic drugs.Methods Analyzed by MTT methods and cytofluorometry,the sensitivity detection of 6 kinds of chemotherapeutic drugs to gallbladder carcinoma cell strain.Results All of the six antitumor drugs was evaluated by MTT methods and cytofluorometry,they were (from high to low):cisplatin(DDP)34.77±3.53,mitomycin C(MMC)33.25±3.40,carboplatin(CDB)15.73±4.50,adriamycin(ADM)15.25±3.56,methotrexate(MTX)14.5±2.13,vincristine(VCR)8.5±1.95.Conclusion DDP and MMC are more chemosensitive than CDB,ADM and MTX especially than VCR.
【Key words】 gallbladder carcinoma;chemotherapy;cytofluorometry
原发性胆囊癌是一种恶性程度高且预后较差的胆系恶性肿瘤，占消化系统恶性肿瘤的第五位，近年来的统计结果表明，其发病有增高趋势［1］。虽然在诊断技术，及治疗方法上有所发展，但治疗5年生存率仅有5%～10%的水平。手术治疗仍然是目前胆囊癌治疗的首选方法，但手术切除率低依然是困扰胆囊癌治疗方法的主要原因，因此，药物化疗就显得至关重要。但目前针对胆囊癌的化疗效果欠佳，且国内外尚无统一、公认显效的联合用药方案。我们选择了5种化疗药物，采用MTT及流式细胞仪(FCM)方法检测其药物敏感性，以期找到临床合理运用化疗方案的科学依据，从而使化疗个体化。本实验研究的结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞来源 胆囊癌细胞系(山东医科大学外科陈博教授提供)。
1.1.2 药物 顺铂、阿霉素、丝裂霉素、卡铂、长春新碱、甲氨蝶呤。
1.1.3 试剂及仪器 RPMI 1640培养基及小牛血清由北京中山公司提供,四甲基偶氮唑盐( MTT ) 及二甲基亚砜( DMSO )由Sigma 公司提供,自动酶标读数仪( 国产DG-3022 )，流式细胞仪 FACScort (Becton Dickinson)。
1.2 方法 （1）胆囊癌细胞在含100%小牛血清的1640培养基，37℃，5% CO2 培养箱中生长。取对数生长期的细胞以每孔5×104个细胞接种于96孔细胞培养板中，37℃，5% CO2条件下培养48h。把所有细胞分为6个实验组和1个对照组，6种不同浓度的化疗药物浓度为［ 药物浓度计算公式为：药物浓度(μg/ml)=60×D/5000÷50%×103，D为临床用药剂量(mg/kg·d)，60为平均成人体重(kg)，50%为红细胞压积，乘103后将mg换算成μg］DDP 40μg/mg、MMC 2μg/ml、ADM 40μg/ml、CDB 300μg/ml、MTX 5μg/ml、VCR 1μg/ml。分别加入6个实验组中，使每孔最终体积为200μl，每个浓度设3个复孔。以无化疗药物的细胞液为空白对照，作用48h后，每孔加1mg/ml 的 MTT 0.1ml；继续培养4h后加DMSO溶液0.1ml,温育30min；在自动酶标读数仪上比色，波长570nm，测出每孔OD值(吸光度值)，结果以高度敏感(抑制率＞70% )，中度敏感 ( 抑制率 50%～70% )，不敏感 ( 抑制率＜50% )判定。抗肿瘤药物对肿瘤细胞抑制率 = (1- 实验组吸光度值/肿瘤细胞对照组吸光度值)×100%。（2）流式细胞仪药敏检测法按（1）所计算浓度分别温育6组胆囊癌细胞48h，并以不加药物的RPMI 1640细胞培养液作阴性对照，收集胆囊癌细胞，PBS洗涤后，4℃下75%乙醇固定12h以上，离心除去乙醇，PBS洗涤，各组加入10mg/ml RNA 酶溶液 150μl，37℃水浴30min，加入碘化丙啶( PI )，用300目尼龙网过滤后4℃下放置15min，转而进行FACScan激光流式细胞仪检测，资料经Cell Quest软件收集和分析。
1.3 统计学方法 采用SAS统计软件进行Student-t 检验。
2 结果
2.1 MTT法测定化疗药物的平均抑制率 不同的化疗药物对胆囊癌细胞的抑制率不同，体外MTT的试验表明，胆囊癌细胞对顺铂及丝裂霉素有较高的敏感性。见表1。
表1 MTT法测定化疗药物的平均抑制率 （略）
注：*临床上以抑制率大于50%为敏感
2.2 流式细胞法测定化疗药物的杀伤率 不同的化疗药物对胆囊癌细胞的杀伤率不同，流式细胞仪药敏测法分析6种药物之中，顺铂、丝裂霉素、阿霉素、卡铂、甲氨蝶呤与对照组相比差异有非常显著性（P＜0.01）；顺铂与丝裂霉素之间，以及阿霉素、卡铂、甲氨蝶呤之间相比均差异无显著性(P＞0.05)；长春新碱与上述5种药物相比均差异有非常显著性(P＜0.01)，而与对照组相比差异无显著性(P＞0.05)，见表2，胆囊癌细胞凋亡情况见图1。
表2 流式细胞法测定化疗药物的杀伤率 （略）
注：与其他组比较差异有显著性，△P＜0.01,▲P＜0.01
图1 采用流式细胞仪分析DDP、MMC、ADM、CDB、MTX、VCR显示的化学敏感性差异（略）
3 讨论
近代肿瘤化学治疗开始于21世纪40年代，近年来随着分子生物学，药物代谢动力学，细胞增殖动力学和分子药理学等学科的发展，抗肿瘤化疗药物的生化机制和作用原理已得到了进一步的阐明。目前已有部分恶性肿瘤可经化疗治愈，如急性淋巴细胞白血病、Hodgkin病、睾丸肿瘤等。作为大部分晚期胆囊癌手术前后的辅助治疗及晚期肿瘤综合治疗的一部分，化疗在提高肿瘤的治疗效果，延长生存期及改善病人的生活质量等方面起到了肯定的作用。
胆囊癌属于对化疗不敏感的恶性肿瘤，而临床收治的患者往往已属晚期，无论采用何种治疗方案均有相当比例失败病例，因为临床医生在没有实验指导下很难做到准确选取有效药物。建立可靠的抗肿瘤体外检测方法，可以帮助临床医师选择有效的化疗药物，合理的设计治疗方案，提高治疗效果，避免无效药物所致的副作用，从而使化疗个体化。我们采用的原理MTT法，是利用活细胞内线粒体脱氧酶能将MTT转化为蓝紫色衍生物甲(formanzan)的原理来检测活细胞数目，产物甲瓒的颜色深浅与细胞数成正比。MTT法的特点是方便、快速，简捷及准确［2］。流式细胞仪药敏检测法，是在细胞悬液中加入碘化丙啶（propidium iodide，PI）进行染色，PI可进入细胞膜受损或死亡细胞内，与DNA特异结合，通过FACS流式细胞仪可检测出活细胞数，得出细胞的杀伤率。根据抗肿瘤细胞数变化，可计算出肿瘤细胞成活率，从而预测患者体内肿瘤细胞对抗肿瘤药物敏感程度。而本实验用两种方法，得出了较为一致的实验结果，胆囊癌细胞对DDP和MMC有较高的敏感性。按照化疗联合用药的基本原理，针对胆囊癌，我们应该以顺铂联合丝裂霉素运用，或者以顺铂和丝裂霉素为主再配合阿霉素、卡铂、甲氨蝶呤中的一种或者两种加以联合运用。
以药物治疗为辅助的综合治疗的重要性正在日益受到人们的关注。目前个案的报道不少，但大宗的临床资料和系统的实验研究尚不多。目前胆囊癌的化疗效果不容乐观，可能部分归因于临床中，胆囊癌的化疗主要经由静脉途径。临床中尝试由经其他途径的给予化疗，如胃网膜右动脉置管入肝动脉，经皮下埋置注药泵，TACE经门静脉化疗等，亦取得了一定的效果［3］，如：腹腔内灌注顺铂对预防和治疗胆囊癌的腹腔转移也有一定的疗效［4］。应当强调，本实验采用的药物浓度主要参考药物在血浆内的浓度，所用药物浓度并不能代表体内药物的实际浓度。另外，由于体外培养的细胞只是适应环境的部分细胞，而很少含氧细胞，故对药物的敏感性与体内结果仍可能有差异。体外药敏实验的实际意义就在于从目前可供选择的化疗药物中筛选出相对敏感药物，再配合合理的给药途径以达到使化疗方案个体化的目的［5］。
【参考文献】
1 朱爱军，石景森.原发性胆囊癌的诊断和治疗.消化病诊断和治疗，2001，1：25.
2 Wilson JK,Sargent Jm,Eligie AW,et al.A feasibility study of chemosensitivity testing in ovarian malignancy.Br J Cancer,1990,62:189-194.
3 牟洪超，王兵.原发性胆囊癌的诊断和治疗.临床军医杂志,2003,31:93-94.
4 Garnero P,Darte C,Delmas PD.A model to monitor the efficacy of alendronate treatment in women with osteoporosis using a biochemical marker of bone turnover.Bone,1999,24:603-608.
5 Yamaue H, Tanimura H, Tsunoda T,et al.Chemosensitivity testing with highly purified fresh human tumor cells the MTT coloricmetric assay.Eur J Cancer,1991,27:1258-1263.
(编辑：江 枫)
作者单位： 430022 湖北武汉，武汉市第一医院 武汉微创外科临床医学中心