PKCα、PCNA、GFAP、EGFR在脑胶质瘤中的表达及临床意义

　　【摘要】  目的  探讨蛋白激酶Cα(PKCα)、增殖细胞核抗原（PCNA）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、表皮生长因子受体(EGFR)的表达、相互关系及其意义。方法  采用免疫组织化学(SABC)法，检测55例脑胶质瘤标本中PKCα、PCNA、GFAP和EGFR的表达。结果  PKCα、PCNA和EGFR的表达随胶质瘤病理分级的增加而增高，而GFAP的表达则随胶质瘤病理分级的增加而降低。PKCα和PCNA、GFAP、EGFR表达间均存在着密切关系。结论 PKCα与胶质瘤的分化程度、恶性程度、细胞增殖等密切相关；PKCα、PCNA、GFAP和EGFR检测可能成为胶质瘤诊断及判断其恶性程度与预后的指标。

　　【关键词】  蛋白激酶Cα；胶质瘤；免疫组织化学
   
　　Expression and their clinical significance of PKCα,PCNA,GFAP,EGFR in human gliomas

　　LIU Hao, LIAO Da-guang, ZHANG Tian-yi,et al.

　　Department of Neurosurgery, The Third Xiangya Hospital,Central South University, Changsha 410013,China

　　【Abstract】  Objective  To evaluate the significance of PKCα, PCNA,GFAP and EGFR expression in human gliomas, and the relationship among them.Methods  Using SABC immunohistochemistry to examine 55 cases of gliomas for PKCα, PCNA, GFAP and EGFR protein expression.Results  The expression levels of PKCα, PCNA and EGFR proteins were increased with the increased grade of malignancy, while the expression level of GFAP was decreased. There was a positive reciprocity between PKCα and PCNA, as well as between PKCα and EGFR. There was a negative reciprocity between PKCα and GFAP.Conclusion  It was evidence that the PKCα protein expression was closely correlated with the degree of differentiation, malignancy and cell proliferation in gliomas. The expression of PKCα,PCNA,GFAP and EGFR can possibly be useful indicators for assessing the degree of malignancy and prognosis.

　　【Key words】  protein kinase Cα；glioma；immunohistochemistry

　　脑胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤。蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)作为信息传导系统的基本物质之一，在胶质瘤的发生、发展中可能起着重要的作用；增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)和表皮生长因子受体(epidermic growth factor receptor,EGFR)与细胞增殖密切相关，被作为观察细胞增殖活性的重要指标；胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)是胶质瘤所表达的特异性蛋白。我们采用免疫组织化学法对脑胶质瘤中这4项指标进行检测，以探讨它们在胶质瘤的发生、发展中的意义及相互关系。

　　1  资料与方法

　　1.1  一般资料  收集2000～2005年手术切除治疗的55例脑胶质瘤患者，其中男37例，女18例，年龄7～72岁，平均38.6岁，术前均未接受放疗及化疗。按照2000年WHO中枢神经系统肿瘤分类标准:Ⅰ级13 例、Ⅱ级10 例、Ⅲ级20例、Ⅳ级12例。5例正常脑组织标本取自颅脑损伤行内减压术患者。均经10%福尔马林固定、石蜡包埋，连续切片（层厚4μm）5张，分别行苏木精—伊红(HE)染色和免疫组化染色。

　　1.2  免疫组化染色  采用SABC法,试剂包括鼠抗人PKCα单克隆抗体、PCNA单抗、GFAP单抗、EGFR单抗、SABC免疫组化试剂盒及DAB显色试剂盒（均购自福州迈新生物技术开发有限公司）。阴性对照片以PBS缓冲液代替一抗，阳性对照片由公司提供。

　　1.3  结果判定标准  细胞质和(或)细胞核内出现棕黄色或棕褐色颗粒者为阳性细胞(染色强度包括弱、中、强阳性)，随机选择10个高倍视野，当出现阳性细胞且≥10%为阳性病例，否则为阴性。阳性部位：PKCα与GFAP均位于细胞质，PCNA位于细胞核，EGFR为细胞膜与胞质。

　　1.4  统计学方法  应用SPSS统计软件(11.0版)进行数据处理，4项指标的组间比较用Fishers Exact Test，相关性分析采用Kappa一致性检验，检验水准α＝0.05。

　　2  结果

　　2.1  PKCα、PCNA、GFAP、EGFR在胶质瘤中的表达  从胶质瘤Ⅰ～Ⅳ级，PKCα、PCNA和EGFR表达均呈上升趋势，而GFAP表达则呈下降趋势，见表1。统计学分析可以看出PKCα、PCNA、EGFR、GFAP在Ⅰ～Ⅳ级各组间均差异有显著性(P＜0.05)。PKCα、PCNA、EGFR 染色强度随胶质瘤分级增高而增强。

　　2.2  脑胶质瘤中PKCα、PCNA、GFAP、EGFR表达的相关性  见表2～4。

　　表1  PKCα、PCNA、GFAP、EGFR 在脑胶质瘤中的表达情况（略）

　　表2  PKCα和PCNA表达的相关性（略）

　　注：Kappa一致性检验系数为0.593，P＜0.05

　　表3  PKCα和EGFR表达的相关性（略）

　　注：Kappa一致性检验系数为0.457，P＜0.05

　　表4  PKCα和GFAP表达的相关性（略）

　　注：Kappa一致性检验系数为-0.427，P＜0.05

　　3  讨论

　　3.1  PKCα与胶质瘤的关系  蛋白激酶C广泛存在于机体的组织细胞内，是重要的信息传导蛋白。PKC生物学作用可以概括为2个方面：首先，在生长因子的作用下，可逆性表达增多，激活有丝分裂原活化蛋白激酶，后者进入细胞核内，促进DNA复制和转录，细胞生长；另外，还可以通过bcl-2等抗凋亡途径，抑制细胞凋亡。PKC有许多同工酶，PKCα属于经典的PKC亚群，激活依靠Ca2+、甘油二酯、磷脂酰丝氨酸。研究发现，PKC的表达有明显的组织特异性，即在不同的系统中，同工酶的种类和作用不尽相同。例如，在恶性胶质瘤中PKCα表达增多［1］，而在结肠癌中则表达减少［2］，提示PKCα在前者有着癌基因的作用，而在后者却有着抑癌基因的作用。Besson等［3］研究发现人脑胶质瘤细胞经佛波酯刺激后，其增殖必须依赖充足的PKCα的表达；Baltuch等［4］也发现PKCα的过度表达与C6大鼠胶质瘤细胞恶性程度有关，提示PKCα与脑胶质瘤关系密切。

　　3.2  PCNA、EGFR、GFAP检测在胶质瘤中的意义  增殖细胞核抗原（PCNA）是一种仅在增殖细胞中合成与表达的分子量为36kD多肽，在DNA复制过程中起作用，其表达合成与细胞增殖状态高度相关，被认为是评价细胞增殖活性的重要指标及临床评价患者预后的参考［5,6］。本研究结果表明：PCNA阳性率随着胶质瘤组织学分级而增高、染色强度增强，统计学分析显示PCNA阳性率在各级胶质瘤间差异有非常显著性（P<0.01），而正常脑组织中PCNA基本不表达。这表明各组织学分级中的胶质瘤细胞增殖活性有明显的差异，因此，它可以成为判断胶质瘤发生及其恶性程度的指标。EGFR是酪氨酸激酶属的受体，主要作用是通过与表皮生长因子结合，从而引起细胞分裂增殖。本文55例胶质瘤中EGFR阳性率为50.9%，并且随着肿瘤分级增加而增加，各级之间差异有显著性(P<0.05)。这提示它与PCNA检测具有类似的临床意义。GFAP是胶质瘤区别于其他肿瘤的特征性标志物。在本文55例胶质瘤中，Ⅰ～Ⅱ、Ⅲ与Ⅳ级阳性率分别为78.3%、45.0%与25.0%，可以看出随着胶质瘤分级增加，GFAP阳性率下降、染色强度减弱，它们差异具有非常显著性（P<0.01）。这说明GFAP与胶质瘤的分化程度有关，即分化越差，GFAP表达越少以至完全不表达。

　　3.3  脑胶质瘤中PKCα与PCNA、EGFR和GFAP表达的关系  信息传导系统发生错误是肿瘤形成的重要原因之一，总的作用结果是增殖加速、凋亡减慢。本研究发现PKCα在人脑胶质瘤标本中的表达明显高于正常脑组织，并且随胶质瘤恶性程度的增高而表达增强，各级之间比较差异有显著性。因此，PKCα可作为判断胶质瘤恶性程度的指标。在胶质瘤标本中，PKCα与PCNA、EGFR均呈正相关，与GFAP呈负相关，在正常脑组织中则未发现这种现象。提示PKCα与胶质瘤的分化程度、恶性程度、细胞增殖等相关。其机制可能为：细胞表面受体，如表皮生长因子(EGF)或血小板衍生生长因子(PDGF)等的激活，通过PI-PLCγ/DAG，PI3K/PIP3或Ras等路径导致PKCα和PKCε以及MAPK级联物质的过度表达，并进一步导致鸟氨酸脱羧酶(ODC)mRNA转录增加，而后者可以使鸟氨酸脱羧酶和多胺的合成增多，加快G1向S期的进程，细胞增殖增加。此外，Harrington等［7］的研究还发现激活PKC可诱导血管形成和内皮增殖，为肿瘤增殖、浸润和远处转移提供基础；抑制PKC活性则能诱导胶质瘤细胞凋亡。

　　本研究为探讨PKCα在胶质瘤发病机制中的作用提供了实验依据，而对其更深入的了解则有待于进一步研究。综合分析PKCα与PCNA、EGFR、GFAP等指标对于胶质瘤的诊断、鉴别诊断及判断其恶性程度与预后均能提供有用的参数，而PKC抑制剂则有望成为临床治疗胶质瘤的新型抗肿瘤药物。

　　【参考文献】

　　1  Leirdal M,Sioud M. Ribozyme inhibition of the protein kinase C alpha triggers apoptosis in glioma cells. Br J Cancer,1999,80(10):1558-1564.

　　2  Assert R, Kotter R, Bisping G, et al. Anti-proliferative activity of protein kinase C in apical compartments of human colonic crypts:evidence for a less activated protein kinase C in small adenomas. Int J Cancer,1999,80(1):47-53.

　　3  Besson A, Yong VW. Involvement of p21 (Waf1/ Cip1) in protein kinase C alpha-induced cell cycle progression.Mol Cell Biol,2000,20(13):4580-4590.

　　4  Baltuch GH, Dooley NP, Rostworowski KM, et al. Protein kinase C isoform alpha overexpression in C6 glioma cells and its role in cell proliferation. J Neurooncol,1995,24(3):241-250.

　　5  方琦,曹军,赵革灵,等.人脑胶质瘤细胞中PCNA的表达与病理分级、患者生存时间的关系.广东医学院学报,2003,21(5):455-459.

　　6  屈建强,杨庆余,师蔚,等.人脑胶质瘤组织中PCNA表达与病理分级、患者预后的相关性研究.西安医科大学学报,2000,21(1):54-55.

　　7  Harrington EO, Loffer J, Nelson PR,et al. Enhancement of migration  by protein kinase C alpha and inhibition of proliferation and cell cycle progression by protein kinase C detta in capillary and othelial cells. J Biol Chem,1997,272(11):7390-7397.

　　(编辑：丁剑辉)

　　作者单位： 410013 湖南长沙，中南大学湘雅三医院神经外科