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【摘要】 目的 探讨RhoA基因与肝细胞癌的发生、发展和侵袭、转移的关系。方法 采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）在半定量水平检测42例肝细胞癌及其相对应的癌旁肝组织中RhoA mRNA的表达，同时采用PCR产物单链构象多态性（PCR-SSCP）银染法检测RhoA基因的突变情况。结果 本组42例肝癌组织中RhoA mRNA光密度相对值明显高于癌旁肝组织（P＜0.01）；有门静脉癌栓者其癌组织中RhoA mRNA光密度相对值明显高于无癌栓者（P＜0.05）。经PCR-SSCP银染法分析未发现异常泳动条带。结论 RhoA基因在肝细胞肝癌进展中起重要作用，并可能与肝癌转移相关。
【关键词】 肝癌；RhoA；基因表达；RT-PCR
Expression and its clinical significance of RhoA mRNA in hepatocellular carcinoma
WANG De-sheng,DOU Ke-feng,XIANG Hong-jun,et al.
Department of Hepatobiliary Surgery,Xijing Hospital,Xi’an 710032,China
【Abstract】 Objective To investigate the expression of RhoA gene in hepatocellular carcinoma and to evaluate the relationship between RhoA gene expression and invasion of hepatocellular carcinoma.Methods The mRNA expression of RhoA gene was examined by RT-PCR in 42 cases of hepatocellular carcinoma and adjacent non-cancerous tissue.In addition,the mutation of RhoA gene was examined by PCR-SSCP.Results The opacity density （OD） of RhoA mRNA expression in hepatocellular carcinoma tissues was significantly higher than that in adjacent non-cancerous tissues （P＜0.01）.The OD of RhoA mRNA expression in hepatocellular carcinoma with intrahepatic metastasis was significantly higher than that without intrahepatic metastasis （P＜0.05）.Mutation was not found in RhoA gene by PCR-SSCP examination.Conclusion The RhoA gene may be related to malignant transformation and development of hepatocellular carcinoma probably by overexpression.
【Key words】 hepatocellular carcinoma;RhoA;gene expression;RT-PCR
原发性肝癌发生率高，手术切除是目前最主要的治疗方法。尽管随着影像诊断和外科技术的进步，尤其是肝移植在肝癌中的运用，肝癌的预后已经有所改善，但肝脏的特殊解剖结构和功能决定着肝癌术后复发率高，术后复发已成为影响患者预后的主要问题。肝癌侵袭转移是主要的影响因素之一，深入研究肝癌侵袭转移机制对于改善肝癌患者的总体预后有重要作用。Rho蛋白和肿瘤发生有密切的关系，参与肿瘤的浸润和转移过程。Rho家族属于Ras超家族，是重要的细胞内信号分子，在细胞的许多基础生命活动中起关键的作用［1］。目前研究证实，Rho蛋白特别是RhoA在肿瘤发生、发展中起重要作用，在结肠癌、乳腺癌、肺癌、头颈癌等均报道有RhoA表达的异常增高［2］。本研究利用RT-PCR技术及分子定量成像系统分析42例肝细胞肝癌（HCC）病人的肝癌组织及癌旁肝组织中RhoA mRNA的表达，并探讨其临床意义。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要试剂及仪器
RT-PCR试剂盒购自MBI公司；dNTP及DNAmarker购自Promega公司；琼脂糖、TRIzol试剂及DEPC购于Gibco公司。凝胶成像系统购自美国Genesis公司；UV-3000型紫外分析仪购自上海天能科技有限公司；PE-2400TMPCR仪购自美国Perkin。
1.1.2 标本来源
42例患者的原发性肝癌组织及相对应的癌旁肝组织来自第四军医大学附属第一医院2004年8月～2005年3月的新鲜手术标本，离体后30min内分装保存于液氮罐中，所有病例均附癌旁肝组织作为对照，分别伴有慢性炎症、纤维化和肝硬化，全部标本均经病理科医师切片确诊。
1.2 方法
1.2.1 扩增引物设计
以GenBank中人RhoA基因全长序列为模板，按引物设计原则予以设计，采用Primer premier 5.0软件设计，其序列如下（U，D分别表示上游和下游引物）：RhoA U1 5’CTGGTGATTGTTGTTGGTGATGG3’,U2 5’GATTCGTTGCCTGAGCAATG3’,D 5’GCGATCATAATCTT-CCTGCC3’。Bactin引物序列：上游引物，5’CGGGAAATC-GTGAT3’;下游引物，5’GAACTTTGGGGG ATGCTCGC3’。其中U1、U2为RhoA上游引物，分别用于定量RT-PCR和PCR-SSCP，D为下游引物。RhoA产物分别为183bp和221bp。
1.2.2 总RNA提取
组织总RNA的抽提取：0.5g组织块，加入Trizol试剂1ml，在电动玻璃匀浆器中，充分匀浆。将全部匀浆液转入1ml离心管中，加0.25ml氯仿，充分振荡混匀，冰浴15min。低温 13000r/min离心15min。小心吸取上层水相至另一1.5ml离心管中，注意不要吸到蛋白层或有机相，加等体积异丙醇，摇匀，室温放置10min，低温13000r/min离心15min，沉淀RNA。加70%酒精漂洗沉淀，5000r/min，离心10min，小心弃去酒精，空气中干燥10min。经电泳证实有两条明显的18S及28S条带，用紫外可见分光光度仪检测RNA的纯度及含量。
1.2.3 RT-PCR扩增RhoA mRNA及鉴定
cDNA制备：应用逆转录试剂盒，总RNA投入量为2μg，使用随机引物。第一链cDNA合成后终体积10μm，具体方法按说明操作。RhoA与Bactin反应同管进行，反应终体积为50μl，反应条件为94℃ 30s，57℃ 30s，72℃ 40s，共25个循环。PCR产物在含0.5g/ml溴化乙锭的1.0%琼脂糖凝胶上电泳，应用凝胶成像系统对条带进行扫描分析。利用分析软件计算并比较每一对样品中RhoA mRNA与B-actin的光密度的相对比值，从而获得每对样品中肝癌组织及癌旁肝组织RhoA mRNA表达的相对含量。
1.2.4 PCR-SSCP分析
PCR反应试剂基本同前，仍用cDNA模板，改用U2和D引物扩增RhoA基因，反应条件为94℃ 1min，57℃ 2min，72℃ 1min，共扩增30个循环。扩增产物变性后行聚丙烯酰胺凝胶电泳，观察泳动条带是否异位以判断突变情况。
1.3 统计学方法
所有数据以均数±标准差（x±s）表示，用SPSS10.0进行分析，组间比较用Student’s t检验，P＜0.05表示有统计学意义，P＜0.01表示有显著的统计学意义。
2 结果
将各样品RT-PCR产物经分子定量成像系统分析，以Bactin条带为内参照，其光密度值设定为1.000，计算RhoA mRNA表达的相对丰度。肝癌组织中RhoA mRNA光密度相对值为（0.276±0.069）；癌旁肝组织中为（0.137±0.058）；两者差异有非常显著性（P＜0.01）。有门静脉癌栓者共17例，其癌组织中RhoA mRNA光密度相对值为（0.316±0.107），无肝内转移灶者为（0.241±0.097）；两者差异有显著性（P＜0.05）。
为探讨RhoA基因突变在肝癌发生发展中可能的作用，我们采用了PCR-SSCP的方法检测RhoA基因中结构改变可能影响RhoA功能的总长为221bp的片段，结果在检测的42例肝癌组织中均未发现异常泳动条带，提示肝癌的发生发展与RhoA基因突变无关。
3 讨论
Rho家族属小G蛋白超家族成员，有GDP结合的活性态和GTP结合的非活性态，两种活性形式之间的转换使他们能够发挥一种类似“分子开关”的作用。活性态的小G蛋白能激活下游的信号传导通路，行使其功能。与Ras基因突变导致其持续激活相似，Rho基因若发生结构改变，使GTP水解发生障碍，而处于持续GTP结合的激活状态，可致其多种功能增强，称为组成型激活突变体，如RhoA（G14V）、RhA（Q63L）等。
Rho家族蛋白参与调节了细胞的多种生命过程，包括肌动蛋白的细胞骨架重组、细胞黏附、细胞运动、细胞周期进展、细胞分裂以及基因转录等，Rho家族分子功能的多样性与其下游效应分子的多样性有关，以RhoA为例，已经发现的RhoA的下游效应分子包括ROCK、PKN、Citron、PI-3K等，这些分子介导了RhoA的作用［3］。越来越多的证据表明，Rho家族蛋白与肿瘤发生发展的各个方面均有联系，包括肿瘤的生长和增殖、侵袭和转移、细胞周期进展、细胞凋亡、肿瘤新生血管的形成等。近年来研究发现，Rho家族成员在多种肿瘤组织中表达增加并和肿瘤恶性程度相关，即在恶性程度高的肿瘤表达更多，提示其在肿瘤发生和转移中具有重要作用。
尽管Rho家族与肿瘤相关的基础研究已有大量报道，但Rho家族与临床肿瘤发生发展关系的研究仍然较少。已有的研究发现，RhoA和RhoB在乳腺癌中的表达增高，且与乳腺癌的恶性表型相关；RhoC主要与有侵袭能力的炎性乳癌有关；Rac1、Rac3和Cdc42在乳腺癌中也有高表达，但与乳腺癌的分期和增殖无关。另外还发现，RhoA在睾丸精原细胞瘤和上尿道肿瘤中的转录水平升高，RhoA和Rac1b在大肠癌中的表达升高，Rac2在头颈部肿瘤中和RhoC在胰腺癌中的表达也是升高的［4］。这些研究提示，尽管Rho家族分子的同源性较高，但它们在不同的肿瘤中可能起不同的作用。Fritz在对乳腺肿瘤的研究中发现，乳腺癌组织较正常组织高表达RhoA,RhoB,Racl,Cdc42蛋白，且RhoA,RhoB,RhoC蛋白表达水平与组织学分级及增殖指数呈明显正相关；而Rho mRNA的表达与正常组织无显著差异［5］。另外，正常乳腺组织、囊性变、非典型增生、导管原位癌均不表达RhoC，其表达与肿瘤组织学分级显著相关。有研究表明乳腺癌组织中RhoA蛋白表达增加，且和乳腺癌的WHO分级相关，即第三级乳癌表达RhoA蛋白较第一级乳癌显著增多。Kamai T用RT-PCR方法检测了睾丸精细胞瘤中RhoA的mRNA表达水平，发现其表达和肿瘤分期相关，恶性程度越高RhoA表达水平也越高，笔者进一步检测睾丸精细胞瘤中RhoA的一种效应器Rho激酶ROCK的mRNA表达水平，也发现肿瘤组织中ROCK表达明显高于相应正常组织，而且RhoA和ROCK的mRNA表达水平呈正相关。该研究提示RhoA基因和睾丸精细胞瘤发生发展有关，且可能通过ROCK起作用［6］。
RhoA与肝癌转移的关系，目前尚未见报道。本研究检测了肝癌组织中RhoA mRNA的表达，发现有门静脉癌栓者RhoA mRNA表达明显高于无癌栓者（P＜0.05），肝癌组织中RhoA mRNA表达亦明显高于相对应的癌旁肝组织（P＜0.01）。提示RhoA基因与肝癌转移关系密切，可能是肝癌转移的必要条件，RhoA mRNA的表达可望成为肝癌转移的参考指标。为了使结果更客观，本实验使用RT-PCR试剂盒，共逆转录与扩增在同一个PCR管中进行，扩增时模板量完全一致，且为高保真酶，减少了错配率。
结果表明，RhoA在肝癌组织中高表达，肝癌组织RhoA表达高于相应癌旁肝组织，高侵袭肝癌组织表达高于低侵袭性肝癌组织，二者差别显著。因此Rho家族成员可能成为一种新的肿瘤标志物，用于判断良恶性及判断肿瘤转移能力和估计预后，具有潜在的重要临床价值。
【参考文献】
1 Mori K, Hata M, Neya S, et al. Common semiopen conformations of Mg2+-free Ras,Rho,Rab,Arf,and Ran proteins combined with GDP and their similarity with GEF-bound forms.J Am Chem Soc,2005,127（43）:15127-15137.
2 Hall A. Rho GTPases and the control of cell behaviour. Biochem Soc Trans,2005,33（5）:891-895.
3 Fujisawa K, Madaule P, Ishizaki T, et al. Different regions of Rho determine Rho-selective binding of different classes of Rho target molecules. J Biol Chem,1998,273（30）:18943-18949.
4 Matos P, Skaug J, Marques B, et al. Small GTPase Racl:structure,localization,and expression of the human gene. Biochem Biophys Res Commun,2000,277（3）:741-751.
5 Fritz G, Brachetti C, Bahlmann F, et al. Rho GTPases in human breast tumours:expression and mutation analyses and correlation with clinical parameters. Br J Cancer,2002,87（6）:635-644.
6 Kamai T, Arai K, Sumi S, et al. The rho/rho-kinase pathway is involved in the progression of testicular germ cell tumour. BJU Int,2002,89（4）:449-453.
基金项目：国家自然科学基金资助项目（编号：30400425）
作者单位： 710032 陕西西安，第四军医大学西京医院肝胆外科
（编辑：李建伟）