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Home医源资料库在线期刊中华现代外科学杂志2005年第2卷第24期

双后肢大鼠增龄制备颈椎间盘退变动物模型

来源:中华现代外科学杂志
摘要:【摘要】目的通过截除幼年大鼠双前肢建立颈椎间盘退变的动物模型。方法健康4周龄雄性SD大鼠76只,随机分为两组,手术组40只,对照组36只。手术组动物麻醉后于双上肢根部截除肢体,分别于术后3、6、9、12个月随机分为4组,每组10只处死大鼠后摄颈椎正侧位X线片,并切取椎体标本制备C2~C3至T2~T3的中矢状面组织学切片......

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    【摘要】  目的  通过截除幼年大鼠双前肢建立颈椎间盘退变的动物模型。方法  健康4周龄雄性SD大鼠76只,随机分为两组,手术组40只,对照组36只。手术组动物麻醉后于双上肢根部截除肢体,分别于术后3、6、9、12个月随机分为4组,每组10只处死大鼠后摄颈椎正侧位X线片,并切取椎体标本制备C2~C3至T2~T3的中矢状面组织学切片,分别进行HE、番红O染色行椎间盘组织学观察。对照组动物分别于实验开始后4、8、12、16个月分为4组进行与实验组相同的处理。结果  截除双前肢后,双后肢大鼠全部存活,实验组大鼠术后9、12个月均出现颈椎间盘退变的X线征象,光镜检查证实其椎间盘均发生了严重的退变,脊索性髓核完全为纤维软骨性髓核取代,软骨终板缺损或消失,基质中胶原纤维排列紊乱,椎间盘突出并骨化。而正常大鼠的椎间盘仅发生轻度退变。结论  本造模方法不损伤动物靶器官正常的解剖结构,成功率高、重复性好,符合人类颈椎间盘退变规律。

  【关键词】  疾病模型;动物;颈椎间盘;X线摄片;组织学
 
  The establishment of degenerative cervical disc animal model in bipedal rats

  WANG Wei-ming,JIN Da-di,QU Dong-bin,et al.

  Department of Orthopaedics,Affiliated Zhongshan Hospital of Dalian University,Dalian 116001,China

  【Abstract】  Objective  To develop a scientific and reproducible degenerative disc animal model for the study on the cervical disc.Methods  The bipedal rats model was developed in 40 infancy SD rats by forelimb amputation.Thirty-six normal rats in the same age served as the control.When the rats in the experimental group were 3,6,9 and 12 months (named E3,E6,E9 and E12 group respectively) and in the control group were 4,8,12 and 16 months (named C4,C8,C12 and C16 group respectively) postoperatively,the vertebral columns from L2~3 to T2~3 were removed and observed under radiographic and histological examination after the rats were sacrificed.Results  After forelimb amputation,all the bipedal rats survived.Overload on the cervical spine elicited by this surgical intervention accelerated the process of cervical intervertebral disc degeneration.Radiographic studies of the vertebral columns of all the animals in the E9 and E12 groups revealed evidence of degeneration characterized by disc-space narrowing,anterior osteophyte formation and disorder alignment.Light microscopy revealed that the degeneration of the nucleus pulposus and cartilage endplate were severe and the collagen fibers in the matrix were irregular in bipedal ratsdiscs.Cervical disc herniation was found in some of the bipedal rats.On the other hand,mild degeneration signs were found in the control group.Conclusion  The availability of this experimental model should be valuable for comprehensive understanding of the pathogenesis of cervical degeneration.The degeneration process of the bipedal ratsdiscs is in agreement with that of human beings.

  【Key words】  disease model;animal;cervical disc;radiography;histology

  颈椎病是严重影响人类健康的常见病和多发病,是颈椎间盘退变的结果,但其发生的具体机制尚不完全清楚,治疗措施亦有待进一步改善。制备一种可靠的颈椎间盘退变动物模型将为更全面地研究其发病机制提供有力的支持,为可能阻止或逆转椎间盘退变的治疗措施提供试验载体。本研究旨在采用双后肢大鼠模型,利用增龄过程中颈部过量的机械负荷,制备颈椎间盘退变简易可靠的动物模型,最大限度地模拟人类疾病的自然过程。

  1  材料与方法

  1.1  实验动物与分组  健康4周龄SD雄性大鼠76只(由大连医科大学实验动物中心提供),体重80~100g,随机分为2组,实验组40只,对照组36只。实验组按术后3、6、9、12个月4个时间段分组(E3、E6、E9、E12),每组10只;对照组按实验开始后4、8、12、16个月4个时间段分组(C4、C8、C12、C16),每组9只。

  1.2  手术操作与标本处理  实验组大鼠以氯胺酮腹腔内麻醉,剂量0.1g/kg,无菌条件下行腋部环形切口,于肱骨中上1/3离断,将上肢肌肉环形结扎于肢体残端以止血,术后动物于笼中自由活动。对照组大鼠未给予任何处置,两组动物均以市售鼠料喂养。

  两组大鼠分别于术后相应时间段以过量乙醚麻醉处死,行颈椎正侧位X线摄片后,剔除周围肌肉,切取颅底到上胸段完整椎体标本,4%多聚甲醛(pH 7.4)4℃固定20h,20%EDTA脱钙,中矢状面连续切片,层厚4μm,分别行HE、番红O染色,制备C2~C3到T2~T3椎间盘单位组织学切片。

  1.3  观察指标  X线摄片观察椎间盘退变情况(椎体排列紊乱、椎间隙变窄、相邻椎体骨赘形成);组织学切片观察椎间盘的退变过程及临近椎体的形态学变化,测量终板软骨及其缺损的宽度。参考Ariga制定的椎间盘退变组织学评价标准[1]进行椎间盘退变的组织学评价,根据终板软骨缺损的宽度占整个终板宽度的比例将椎间盘分为正常(无终板缺损);轻度退变(终板缺损<整个终板宽度的25%);中度退变(终板缺损占整个终板宽度的25%~50%);重度退变(终板缺损超过整个终板宽度的50%)。终板软骨的缺损根据其带状结构消失或仅有间断的残留带状结构进行判断。

  2  结果

  2.1  影像学表现  C4、C8、C12、E3、E6组均未发现椎间隙变窄、椎体前缘骨赘形成及椎体排列异常等椎间盘退变的表现(见图1、图2)。C16组中4只,E9、E12组全部大鼠均表现出不同程度的退变征象,以E12组大鼠及C4~C5、C5~C6、C6~C7椎间隙表现明显(见图3、图4)。

  图1  C12组颈椎侧位片示椎体排列整齐(略)

  图2  E6组大鼠颈椎摄片示椎间隙宽度正常(略)

  图3  E9组大鼠颈椎侧位片示椎间隙狭窄,椎体前缘骨赘形成 (略) 

  图4  E12组大鼠颈椎摄片示椎体排列紊乱,椎体前缘骨质增生(略)

  2.2  组织学表现  C4、C8、C12组大鼠大多数椎间盘组织学表现正常(见图5),终板由一薄层透明软骨组成,髓核位于椎间盘的中央,脊索细胞数量较少,呈索条状分布,部分脊索细胞成团分布,极少有退变坏死的脊索细胞。少数切片可见与终板软骨联系紧密的软骨样细胞。髓核四周由纤维环包绕,纤维环具有规则致密的层状结构,胶原束排列整齐平行,以成纤维细胞为主。C16、E3及E6组大部分椎间盘的脊索性髓核皱缩,髓核组织中大多数为软骨样细胞,脊索细胞数量较少且大部分出现变性,软骨终板变薄、前部纤维环层状结构消失,个别椎间隙可见脊索性髓核消失及纤维环的裂隙(见图6)。E9组椎间盘退变加剧,表现为脊索性髓核完全被纤维软骨样组织替代、纤维环出现裂缝、软骨终板变薄并出现缺损(见图7)。个别间隙可见椎间盘突出及相邻椎体的骨赘形成。E12组的椎间盘退变最严重,表现为软骨终板消失、椎间盘突出及相邻椎体前缘骨赘形成(见图8)。纤维环的变性及破裂,使纤维软骨性髓核向椎体边缘突出,超过椎间盘的边界,最终发生软骨内骨化(见图9)。根据终板缺损宽度确定各组中椎间盘退变的半定量分级表明,实验组较对照组椎间盘退变发生的更早且更严重(见表1、图10、图11)。

  表1  各组间椎间盘退变病理分级(略)

  图10  对照组椎间盘退变组织学分级(椎间盘数为63个/组)(略)

  图11  实验组椎间盘退变组织学分级(椎间盘数为70个/组)(略)

  3  讨论

  通过制备动物模型复制人类的疾病过程是医学研究的重要方法和促进医学科学发展的重要途径,在疾病的病因或发病机制的探讨以及预防与治疗方法的选择与改进上都起着举足轻重的作用。在颈椎间盘退变性疾病的研究中也是如此,Whitehill等[2]、Miyamato等[3]均通过破坏动物颈椎静力性稳定结构来制备颈椎退变的动物模型;彭宝淦等[4]则通过手术直接破坏大鼠颈背部肌肉,造成颈椎动力性平衡失调以制备模型。另外,不少学者采用切开纤维环外层、注射盐水等方法在家兔、犬、羊等动物上诱导出椎间盘退变模型[5,6],但其退变原因为纤维环或椎间盘巨大的物理化学损伤,与引起人类椎间盘退变的积累性轻微损伤的变化不同。而那些通过从外部机械装置对动物脊柱施加异常应力诱导出退变的模型也与人体生理情况不符[7]。Coff于1974年报道通过双后足大鼠模拟人类直立行走时的受力状态,制备腰椎间盘退变的动物模型[8]。然而,在Coff的模型中将出生24~48h的幼鼠截除双前肢后其成活率极低,故虽然该方法在理论上更接近人类疾病发生的自然状态,但并未得到广泛应用。大鼠在进食过程中喜以双前爪辅助抓持铁笼或鼠料,受制备双后足大鼠模型的启发,本研究将已断奶的4周龄大鼠截除双前肢,使其不得不依靠颈部的过度用力和扭转方可顺利进食,在增龄的过程中颈椎间盘将承受过多的剪力负荷,不断发生积累性损伤,逐渐产生颈椎间盘退变性改变。

  尽管正常SD大鼠为非直立动物,但与人类颈椎间盘的增龄变化相类似,其颈椎间盘也会随着年龄的增加缓慢发生退变,只是退变程度较人类轻微。在人类新生儿期髓核几乎占据椎间盘的1/2,出生时主要是由脊索组织组成。脊索组织由内胚层的脊索演化而来,是由一种柔软的凝胶状基质包绕多核索状物和脊索细胞簇而成。出生后由于椎间盘受力方式发生改变,随着年龄的增长在脊索细胞数逐渐减少的同时,髓核中出现软骨样细胞,并出现越来越多的胶原纤维。在成人终板软骨变薄,髓核逐渐缩小并纤维化,存活细胞急剧下降,脊索细胞分布稀少,在髓核中央散在有软骨细胞。老年人的终板软骨几乎消失,整个椎间盘通常变成僵硬的纤维软骨,在椎间盘的中央很少有活性细胞存在[9]。从本实验的结果来看,对照组大鼠髓核中的脊索细胞在增龄的过程中逐渐发生退变,从紧密连接形成索条状的脊索细胞簇逐渐转变为游离细胞,终板软骨细胞沿增生的胶原纤维向髓核迁移并最终完全替代脊索细胞。而双后肢大鼠的退变发生的更早也更为严重,终板软骨变薄、缺损直至消失,脊索细胞完全被类软骨细胞替代,出现大量坏死细胞及碎片,相邻椎体边缘明显骨赘形成,椎间盘组织突出并骨化。X线摄片亦表明实验组大鼠出现椎间隙狭窄、椎体排列紊乱、相邻椎体边缘骨赘形成等椎间盘退变的影像学表现较自然增龄大鼠出现更早(E9组/C12组)且更严重(E12组/C16组)。双后足大鼠颈椎间盘的各种变化与人类颈椎间盘退变规律基本一致。

  大鼠来源广泛、价格低廉、饲养方便、生命力强,是生命科学研究中最常用的实验动物,如何利用大鼠模型来进行椎间盘疾病的各项研究一直备受关注。从本研究的组织学和影像学变化可以看出,随着年龄的增加,双后肢大鼠的生理活动导致颈椎间盘承受的应力增加,发生了严重的组织退变,其椎间盘退变的病因和发展规律与人类颈椎间盘退变相似。采用截肢手术建立双后肢大鼠颈椎间盘退变的模型不损伤靶器官正常的解剖生理结构,简单易行,成功率高,重复性好,为更深入地研究颈椎间盘退变的发病机制及防治措施提供了可靠的实验载体。

  (本文彩图见封三)(略)

  【参考文献】

  1  Ariga K,Miyamoto S,Nakase T,et al. The relationship between apoptosis of endplate chondrocytes and aging and degeneration of the intervertebral disc. Spine,2001,26: 2414-2420.

  2  Whitehill R,Monran DJ,Fechner RE,et al.Cervical ligamentous instability in a canine in vivo model.Spine,1987,12 (10):2959-2963.

  3  Miyamato S,Yonenobu K,Keiro O.Experimental cervical spondylosis in the mouse.Spine,1991,16(10Suppl):S495-500.

  4  彭宝淦,施杞,沈培芝,等.一个新的实验性颈椎病动物模型.中国中医骨伤科杂志,1997,4(5):10-12.

  5  Osti OL,Vernon RB,Frcrath RE,et al.Anulus tears and intervertebral disc degeneration.Spine,1990,15(8):762-767.

  6  赵定麟,陈德玉,沈强,等.实验性颈椎病模型的设计.中华外科杂志,1993,31(8):453-455.

  7  余家阔,吴毅文,戴先进,等.颈椎病生物力学发病机制实验研究.安徽医科大学学报,1990,15(1):47-50.

  8  Goff CW,Landmesser W.Bipedal rats and mice.J Bone Joint Surg Am,1974,39:2616-2622.

  9  陈启明(译).骨科基础科学,第2版. 北京:人民卫生出版社,2001,479-481.

  (编辑:杨  熠)

  作者单位: 116001 辽宁大连,大连大学附属中山医院

        510515 广东广州,南方医科大学南方医院(△通讯作者)

 

作者: 王卫明,金大地,瞿东滨 2006-8-29
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