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［摘要］ 目的 探讨谷氨酰胺联合肠内营养对动物模型结肠黏膜凋亡的影响。方法 将大鼠随机分为3组，即正常组，模型组、谷氨酰胺组21天两个时间点进行观察。结果 谷氨酰胺组Bcl-2的平均灰度值及表达阳性的面积明显大于其他组，Bax基因蛋白平均灰度值及表达阳性的面积明显小于其他组（P<0.05）。结论 谷氨酰胺能抑制结肠黏膜细胞的凋亡，促进结肠的代偿。
［关键词］ 谷氨酰胺；短肠综合征；结肠黏膜；凋亡
Influence of glutamine to apoptosis of colon mucosa rat of short bowel syndrome model
LIN Fang-cai，SUN Xin，ZHAO Da-zhong，et al.Department of General Surgery，Beijing Dianli Hospital,Beijing 100073，China
［Abstract］ Objective To detect the influence of glutamine combined with enteral nutrition to apoptosis of rat colon mucosa model.Methods Rats have been divided into 3 groups，that is normal group，model group and glutamine group，which were observed at 21th day.Results Glutamine group Bcl-2 and Bax gene protein’s average gray density and expression planimeter are different significantly with other groups.Conclusion Glutamine group Bcl-2 and Bax gene protein’s average gray density and expression planimeter are significantly with other groups.Glutamine group can prevent apoptosis of colon mucosa enhance compensation of colon mucosa of rats.
［Key words］ glutamine;short bowel syndrome;colon mucosa；apoptosis
细胞凋亡是生物界重要的生命现象之一，结肠黏膜屏障的变化是肠内营养支持过程中结肠代偿的显著特点，结肠黏膜所有变化都是由凋亡基因和抗凋亡基因调控着，本研究采用免疫组化方法来观察短肠大鼠在行谷氨酰胺肠内营养支持过程中结肠黏膜凋亡变化的特点。
1 材料与方法
1.1 实验动物 选择清洁级SD大鼠，雌雄各半，雄性体重（325±25）g，雌性体重（320±15）g，6个月龄，由北京维通利华实验动物中心供给，合格证号为：京动许字(2000)第004号(总049号)。
1.2 实验环境 大鼠饲养和实验均在北京中医药大学临床药理研究中心清洁级动物实验室内进行，合格证号为：SYXK 11-00-0029，京动许字(1999)第039号，医动字第01-2094号(1999)。大鼠饲料为消毒饲料，由北京科澳协力饲料有限公司供给。大鼠垫料为消毒垫料，笼具用过氧乙酸溶液消毒。饮用水为消毒水。自由摄取食物和饮水，光照与黑暗为12 h交替，室温为22 ℃～25 ℃。
1.3 药物 百普素(PEPTI-2000 variant)粉剂，由短肽链乳清蛋白、中链甘油三酯和麦芽糖糊精等组成，由荷兰Nutricia公司生产，进口号X20000386。3.5%水合氯醛药理研究中心清洁级动物实验室自行配制。青霉素钠粉剂（华北制药股份有限公司生产，批号：9807128）。健脾敛肠汤（由党参、黄芪、白术、石榴皮等补气收涩的中药组成）。
EDTA抗原修复液，Bcl-2抗体（大鼠IgG即用型抗体，美国Santa Cruz 公司，购自北京中山生物技术有限公司），抗抗体（大鼠IgG即用型抗体，美国Santa Cruz 公司），SP系列试剂盒(SistostainTM-SP kits)，其中包括封闭用山羊血清、生物素标记二抗、辣根酶标记链霉卵白素，DAB显色试剂盒，所有免疫组化用试剂均购自北京中山生物技术有限公司。
1.4 仪器 天平，代谢笼，光学显微镜（日本Olympus公司），半自动图像分析仪VIDSⅢ，Olivetti M24型（AMS公司，英国），SPOTⅡ SOFTWARE V3.0图像拍摄系统（美国DIAGNOSTIC INSTRUMENTS 公司），Metamorph Imaging System Version 4.5 图像分析软件(美国Universal Imaging Corporation 公司)。
1.5 实验方法
1.5.1 动物分组 将大鼠随机分为3组，即正常组、模型组、谷氨酰胺组，共24只，每组各8只，雌雄各半。
1.5.2 制作动物模型 实验前适应性喂养大鼠1周，大鼠术前16～18 h禁食，自由饮水。术前称体重，3.5％水合氯醛(1 ml/100 mg)腹腔麻醉，麻醉成功后，将大鼠仰卧位缚于木板上，剪去腹部体毛，用碘伏溶液消毒手术区域，铺无菌巾单。做腹部正中切口，长约3 cm，剖腹后找到肠系膜上的小肠静脉，注入生理盐水2 ml，预防术中失血性休克。保留距Treitz韧带1 cm近段空肠和距回盲瓣12 cm的回肠，分段处理肠系膜，切除全部小肠，然后以6-0无损伤缝线行空回肠端端一层吻合，并于乙状结肠造瘘，插入直径3 mm硅胶管，收紧结扎造瘘口的荷包缝线，将硅胶管从腹直肌、皮下戳创引至背部双肩中间，造口拉出，缝合皮肤切口并固定硅胶管，最后关闭腹部切口。术前30 min腹腔注射抗生素及术后3天肌注抗生素。
1.5.3 营养液配制及给予方式 （1）正常组予以正常饮食，模型组只予以百普素，谷氨酰胺组除予以百普素外还予以谷氨酰胺，给予的药物剂量均按人和动物的每公斤体重等效剂量折算系数表计算，给予谷氨酰胺3.75 g/（kg·d）。模型组和谷氨酰胺组术后12 h经造瘘管4次/d滴注营养素（百普素），浓度为25.2％(80 kcal)，共80 ml。溶于生理盐水中于每日晨空腹时泵入，每日1次。各组大鼠每天喂养时间相同。
1.5.4 标本收集 术后21天，麻醉、剖腹，取出全部大肠，20%甲醛液固定，乙醇脱水，石蜡包埋。将每一石蜡包埋的标本连续切片5张，每张厚度为4 μm，载于玻片上，其中一张用于常规HE染色，用于Bcl-2和Bax检测各1张，用于阴性对照各1张。
1.5.5 免疫组化染色步骤 (1)石蜡切片脱蜡至水；（2）微波修复抗原，90 ℃～95 ℃，10 min；（3）蛋白酶Ｋ消化，15 min；（4）3％H2O2室温孵育5～10 min；(5)蒸馏水冲洗，PBS浸泡5 min；(6)5%～10%正常山羊血清(PBS稀释)封闭，室温孵育10 min。倾去血清，滴加稀释的一抗，50 μl／片，37 ℃孵育1 h；(7)PBS冲洗，5 min×3次；(8)滴加适当比例稀释的生物素标记二抗(1％BSA-PBS稀释)，37 ℃孵育20 min；(9)PBS冲洗，5 min×3次；(10)滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素(PBS稀释)，37 ℃孵育20 min；(11)PBS冲洗，5 min×3次；(12)DAB显色剂显色；(13)自来水充分冲洗，苏木素复染，脱水，透明，中性树胶封片。
1.6 图像分析
1.6.1 肠壁周长及肠壁厚度、皱襞高度的测量 在SPOTⅡ显微图像分析系统中用1.25倍物镜拍摄，应用Metamorph图像分析软件Region measurement功能自动计算肠壁周长及肠壁厚度、皱襞高度。
1.6.2 Bax、Bcl-2蛋白表达平均灰度值及阳性面积的测量 在200倍光镜拍摄照片，在图像分析系统中随机选取每张照片面积相等的5个视野，应用Metamorph图像分析软件Region measurement功能测量平均灰度等值后取平均值为每张片子的最后结果。
1.7 统计学方法 统计计算采用SPSS11.5软件包进行。多组间比较采用F检验，两两比较采用q检验，所有数据均以均数±标准差(x±s)表示，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
观察各组Ｂcl-2、Bax蛋白表达区域光密度的变化。术后第21天，谷氨酰胺组Bcl-2的平均灰度值及表达阳性的面积明显大于其他组，Bax基因蛋白平均灰度值及表达阳性的面积明显小于其他组。见表1、表2。表1 Bcl-2及Bax蛋白表达平均灰度值注：与模型组比较，★P<0.01；与正常组比较，▲P<0.05
3 讨论
肠黏膜屏障在当今临床外科中的地位愈发显得重要，因为在严重创伤、手术、放化疗等应激状态和长期禁食实行肠外营养的状态下，肠黏膜屏障可受到严重损害，导致细菌移位、内毒素血症。既往一提起肠黏膜屏障，临床医师首先想到的是小肠黏膜屏障。但近年来学者们发现结肠黏膜屏障也不容忽视，因为结肠内含有超过小肠内数倍的细菌，以大肠杆菌、厌氧菌居多。调控结肠黏膜屏障的基因有Bcl-2、Bax、Fas、Fas/L、c-Myc、p53，而这些基因又是调控凋亡的主要基因，正是由于它们的存在，才使得结肠黏膜细胞不断地更新，而不是病理性坏死。虽然Kerr等在1972年提出了细胞凋亡(apoptosis)一词，但直到20世纪90年代初期，随着对细胞凋亡认识的进步，人们才将那些生理性细胞死亡冠以细胞凋亡的名称［1］。细胞凋亡是生物界重要的生命现象之一，从生理到病理，体内的不同细胞多具有此种死亡形式。凋亡细胞与坏死和正常细胞在细胞形态、分子水平及蛋白表达方面存在很大的差别，凋亡细胞形态学特征上主要表现为核染色质固缩，集聚于核膜周边，呈月牙状斑块，内质网扩张，浆膜表面起泡突起并有凋亡小体形成。凋亡是受遗传基因调控的一个有序过程，人们发现细胞凋亡与细胞增殖有着许多潜在的联系［2］。从细胞形态学上看，细胞凋亡与有丝分裂的超微结构事件，如核膜消失、染色体凝集、细胞膜内陷等，有着许多共同之处；从分子水平上看，许多与细胞增殖的基因，如c-Myc，p53也与细胞凋亡有关。在细胞凋亡调控机制方面，Bcl-2是迄今研究得最深入、广泛的凋亡调控基因，Bcl-2基因是第一个被发现的细胞凋亡抑制基因，是Tsujimoto和Crose等1985年从伴有t(14，18)染色体易位的滤泡状B细胞淋巴瘤中发现的［3］，定位于18q21，大约长230kb，含3个外显子和2个内显子，与Ced-9基因有23％的同源性，Bcl-2基因是一种凋亡抑制基因，有抑制细胞凋亡的作用，Bcl-2基因编码蛋白分子量约25kD，位于核膜、部分内质网及线粒体外膜上；Bax为Bcl-2家族成员之一，其蛋白分子量为21 kD，Bax基因DNA包括6个外显子，由于其转录形式的mRNA拼接方式不同，可产生膜蛋白Baxα和胞浆蛋白Baxβ、Baxγ三种蛋白；其过度表达与细胞凋亡有密切关系，其作用可抵消或减轻Bcl-2的抑制凋亡效应并促进凋亡的发生，因而Bax基因被称为凋亡促进基因［4］。在多种刺激因素作用下，Bax蛋白在细胞内的分布发生改变，正是Bax的再分布在细胞凋亡过程中起着重要作用。Bax基因与Bcl-2基因有一定的同源性，功能却完全不同。有文献报道细胞凋亡的程度与Bcl-2/Bax的比例有关。
本实验中通过免疫组化方法检测上述两种基因的蛋白在结肠黏膜中的表达，发现谷氨酰胺组与模型组差异有统计学意义（P<0.05），大鼠的结肠黏膜均有Bcl-2，Bax相关蛋白的表达，Bcl-2的表达强于Bax；在模型组Bcl-2的表达明显低于正常组（P<0.05），而Bax的表达虽稍高于正常组，但差异无统计学意义（P>0.05），Bcl-2/Bax的比例下降。谷氨酰胺促进结肠黏膜的增殖，抑制其凋亡，促进结肠黏膜的代偿。
［参考文献］
1 曾益新.肿瘤学.北京:人民卫生出版社，2001，113-115.
2 King KL，Cidlowski JA.Cell cycle regulation and apoptosis.Annu Res Physiol，1998，60:601.
3 Knudson CM，Korsmeyer SJ.Bcl-2 and Bax function independently to regulate cell death.Nature Medicine，1997，16:358.
4 Kirshenbaum LA，Moissac D.The bcl-2 gene product prevents programmed cell death of ventricular myocytes.Circulation，1997，96:1580-1585.
6 Steller H.Mechanism and genes of cellular suicide.Science，1995，267:1445.
作者单位： 100073 北京，北京电力总医院普外科
(编辑：陆 华)