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【摘要】 目的 探讨ADM诱导MCF-7耐药后细胞免疫表型的改变及临床意义。方法 将人乳腺癌细胞株分为三组：MCF-7（野生组）、MCF-7/ADM（阿霉素诱导的耐药组）、MCF-7/撤药60天（撤药60天组），S-P免疫组化法检测细胞表型变化。结果 MCF-7/ADM的耐药相关标志蛋白P-gp、LRP、GST-π及HER-2表达较MCF-7明显增加，而雌激素受体（ER）、TOPO-Ⅱ转为阴性表达，孕激素受体（PR）随撤药时间的延长表达逐步减低。结论 耐药细胞的遗传和免疫表型发生了变化，药物作用的靶酶表达或靶功能发生了改变，部分撤药后不能逆转。
【关键词】 多药耐药相关蛋白；人类表皮生长因子受体；雌激素受体；孕激素受体；免疫组化染色
Immunophenotype alteration of drug resistant human breast carcinoma cell line MCF-7 induced by adriamycin
YU Xiao-yu，ZHANG Rong-rong，CAI Ying.Department of Pathology，Jiangyuan Hospital of Jiangsu，Wuxi 214063，China
［Abstract］ Objective To investigate immunophenotype change of drug-resistant human breast carcinoma cell line MCF-7 induced by adriamycin.Methods Immunophenotype alteration of MCF-7（wild group），MCF-7/ADM（MCF-7 exposed to ADM） and MCF-7/60day（withdrawal group，60 days after exposure） was detected by using SP immunohistochmistry method respectively.Results The expression of drug resistance associated marker of MCF-7/ADM cells such as P-gp，LRP，GST-π，HER-2 was higher than MCF-7，ER and TOPO-Ⅱ turned to express negatively.Expression of PR decreased gradually after withdrawal.Conclusion MCF-7 cells exposed to ADM got characterization of drug resistant and their immunophenotype alteration could not be reversed after withdrawal.
［Key words］ multidrugresistance；human epidermal growth factor receptor-2；estrogen receptor；progesterone receptor；immunohistochemistry
乳腺癌是危害妇女健康的主要恶性肿瘤，复发率和转移率高，全世界每年约有120万妇女发病，有50万妇女死于乳腺癌。化学药物疗法是治疗乳腺癌的主要手段之一，但肿瘤细胞产生的多药耐药常使化疗难以奏效并最终导致化疗失败。肿瘤耐药异常复杂，是多基因、多步骤综合作用的结果，我们从多药耐药后乳腺癌细胞免疫表型的改变，对乳腺癌细胞多药耐药的机制进行了研究。
1 材料与方法
1.1 材料 细胞株：MCF-7培养于含10%热灭活小牛血清的RPMI1640培养液中，细胞传代时用含0.25%胰蛋白酶进行消化，采用低浓度加量诱导法［1-2］诱导亲本MCF-7细胞，阿霉素（ADM）对亲本MCF-7 IC50的1/10为起始浓度，逐步提高细胞培养液中的ADM浓度，待每个ADM浓度细胞稳定生长后再逐步提高药物浓度，同时监测ADM对细胞的IC50。
MCF-7人乳腺癌细胞购于ATCC公司，RPMI1640为Gibco公司产品，胰蛋白酶、小牛血清为华美生物工程公司产品，胰岛素注射液为上海生物化学制药厂生产，人P-gp、LRP、GST-π、TOPO-Ⅱ、ER、PR免疫组化试剂为福州迈新生物技术公司产品。
1.2 方法 把细胞株分成三组：MCF-7、MCF-7/ADM、MCF-7/撤药60天，涂片后进行免疫组织化学染色。把细胞均匀涂在经多基赖氨酸处理的载玻片上，采用S-P法，所用一抗为P-gp、LRP、GST-π、TOPO-Ⅱ、ER、PR。阳性定位：P-gp、LRP核膜/胞浆、GST-π胞浆，TOPO-Ⅱ、ER、PR胞核，HER-2胞膜；判断标准：P-gp、LRP、GST-π阳性（++）以上为耐药，TOPO-Ⅱ（-）/（+）为耐药，ER、PR阳性细胞数>10%为阳性表达。
2 结果
免疫组织化学结果，见表1。
MCF-7多药耐药相关蛋白P-gp、LRP、GST-π及HER-2阴性表达，TOPO-Ⅱ阳性表达，ER、PR阳性表达；MCF-7/ADM P-gp、LRP、GST-π、HER-2转阳性表达，MCF-7细胞的标志性受体ER转为阴性表达；MCF-7/撤药60天P-gp、LRP表达减弱，GST-π、HER-2表达仍然较强，受体PR随撤药时间的延长表达逐步下降（图1）。表1 免疫组织化学结果
3 讨论
乳腺癌是我国大城市中女性主要癌症之一，传统的治疗手段包括手术、内分泌治疗、化疗和放疗，其中化学药物疗法是治疗乳腺癌的主要手段之一。对化疗药物的耐受，是化疗失败的主要原因。人类在肿瘤的临床化疗中，肿瘤细胞对1种抗肿瘤药物出现耐药性的同时，对其他多种结构不同、作用靶位不同的抗肿瘤药物也产生耐药性，这就是所谓的多药耐药。这是因为药物耐受细胞的遗传和生化特性发生了复杂的变化［2］，使细胞通过许多不同的途径对药物产生耐受，药物作用的靶酶表达改变或靶功能改变。研究多药耐药细胞性质和行为的改变，有助于对多药耐药机制的解析。
耐药的产生往往涉及许多耐药相关标志的表达，许多已被用于化疗过程的监测及疗效判断［4～6］肿瘤耐药机制主要是从多药耐药基因表达的产物入手，主要有P-gp、LRP、GST-π、TOPO-Ⅱ等。P-gp是一种跨膜糖蛋白，由MDR1基因编码所产生，起外流泵作用，能将抗肿瘤药物逆浓度从细胞内泵出到细胞外，从而降低细胞内药物浓度导致肿瘤耐药。LPR并非只存在于肺部肿瘤中，它广泛分布于正常组织，引起多药耐药的机制是以细胞核为效应的药物转运到胞浆中，将进入胞浆的药物运到运输囊泡中，隔绝药物作用，并以胞吐的方式排出体外，从而产生耐药。TOPO-Ⅱ是一种能催化DNA起螺旋结构局部构型改变的基本核酶，化疗药物通过该酶与DNA交联形成共价复合物，即可分割复合物，引起DNA断裂，导致肿瘤细胞死亡，该酶减少或活性下降，可使肿瘤细胞不因DNA断裂而死亡，从而产生耐药。GST-π主要生理功能是参与机体解毒，在许多耐细胞系中，与表达MDR表型的细胞系相关，导致肿瘤耐药的可能机制为催化谷胱甘肽与各种亲电子分子和疏水性分子结合，使其更有极性而加强外排，通过非酶结合方式将细胞内的毒性化学药物排除。
对乳腺癌患者的调查显示：ER、PR阳性者约占乳腺癌的75%，ER、PR阳性乳腺癌虽然也存在肿瘤的异质性，但几乎都具有雌激素诱导的增殖效应，属于内分泌治疗的敏感肿瘤［7］。乳腺肿瘤组织不表达ER、PR，表明该肿瘤细胞已不受内分泌调节，采取内分泌治疗效果不好，两种受体对于指导治疗、疗效预测及预后评价有很大价值。ER、PR阳性患者的预后相对较好。
HER-2是一种原癌基因，参与调控细胞的生长、增殖及分化，是公认的重要的肿瘤分子标志物之一［8］。其过度表达是多种恶性肿瘤的表型，现也被广泛用于乳腺癌的预后评价及指导治疗［9］。HER-2异常导致乳腺癌危险增加的因素包括：HER-2基因突变；HER-2磷酸化状态；其他信号因子及传导通路的异常［10］。因此，HER-2阳性乳腺癌患者较HER-2阴性的无瘤生存率和总生存率显著降低。
本实验表明：MCF-7/ADM细胞模型的耐药相关蛋白P-gp、LRP、GST-π的表达水平都较MCF-7细胞有显著增加，而 MCF-7细胞的标志性受体ER转为阴性表达，受体PR随撤药时间的延长表达逐步下降，提示MCF-7经ADM诱导后细胞产生了多药耐药性，ER、PR、HER-2等免疫表型也同时发生了改变，且撤药后大多数指标不能逆转。
多药耐药机制目前尚未完全了解，其产生是乳腺癌化疗失败的主要原因。从本实验结果可以分析，导致乳腺癌耐药后治疗失败的原因，主要有三个途径：（1）MCF-7/ADM细胞在获得耐药性的同时，细胞行为发生了变化，耐药细胞具有去分化的能力，且具有生长优势，对化疗药物有很强的耐受性；（2）ER表达缺失，失去对雌激素的依赖性，内分泌治疗效果差；（3）HER-2表达增高。
许多研究曾设想用阻断多药耐药的方式达到满意的药效和安全的要求，因而从采用MDR逆转剂的研究来解决MDR问题，均没有达到预期的效果。笔者从研究中发现ADM诱导MCF-7细胞耐药后的细胞行为发生了明显变化，为通过研究和完善MDA机制及肿瘤细胞MDR后的改变、解决ADM诱导MCF-7细胞耐药后去分化趋势的发展结局，解析其原因并开展肿瘤细胞MDR的药物靶点研究提供了一定依据。
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作者单位：1 214063 江苏无锡，江苏省江原医院病理科 2 214002 江苏无锡，无锡市第二人民医院病理科