CK20和NMP22在尿路上皮癌中的表达和意义

【摘要】  　　目的 探讨细胞角蛋白20（CK20）和核基质蛋白22（NMP22）在尿路上皮癌中的表达和意义。方法 应用RT-PCR法和酶联免疫法（ELISA）分别检测30例尿路上皮癌（26例移行细胞癌、2例鳞癌、1例腺癌、1例内翻性乳头状癌）、8例正常尿路上皮组织标本中CK20mRNA表达和尿中NMP22的水平。结果 CK20mRNA在30例尿路上皮癌中阳性表达率为93.3%。NMP22在尿路上皮癌中的含量明显高于对照组，分别为（20.7±9.8）u/ml和（6.1±0.8）u/ml，P<0.01，而且与肿瘤病理分级和临床分期明显相关。NMP22诊断尿路上皮癌的敏感性、特异性分别为63.5%和65.9%。结论 CK20和NMP22的表达与尿路上皮癌的生物学行为密切相关。NMP22与尿路上皮癌的恶性程度呈正相关，CK20和NMP22可协同参与尿路上皮癌的生物学行为。

【关键词】  尿路上皮癌 细胞角蛋白20 核基质蛋白22

　　Expression and significance of cytokeratin 20 mRNA and nuclear matrix protein 22 in urothelial cancer

    LIN Yi，CHEN Wen-xuan，QIANG Wan-ming，et al.Department of Urology，Tianjin Medical University General Hospital，Tianjin 300052，China

    ［Abstract］ Objective To study the correlation of cytokeratin 20 （CK20） mRNA and nuclear matrix protein 22 （NMP22） in urothelial cancer.Methods RT-PCR was used to determine the expression of CK20 mRNA in 30 urothelial cancers （26 transitional cell carcinomas，2 phosphrote carcinomas，1 adeno carcinoma，1 inverted papilloma），and 8 normal tissues.NMP22 levels in urinary were determined by an enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） in urothelial cancers.Results The positive rate of CK20 mRNA in 30 urothelial cancer was 93.3%.The median NMP22 value was significantly higher than control group ［（20.7±9.8）u/ml versus （6.1±0.8）u/ml］ in urothelial cancer.The values of NMP 22 was found to be positively correlated to the degree of the differentiation and the clinical staging of the urothelial cancer.The sensitivity and specificity of NMP22 were 63.5% and 65.9%，respectively.Conclusion The results suggest that CK20 mRNA and NMP 22 play important role in the occurrence and development of urothelial cancer.These findings suggest that the detection of multiple factors is more valuable than that of single factor.

    ［Key words］ urothelial tumor；cytokeratin20；nuclear matrix protein 22

    尿路上皮癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，其中90%以上为移行细胞癌，其特点为术后复发率高，往往复发后其恶性度增大，而且肿瘤的浸润和转移倾向增强，肿瘤的生物学行为受多种基因的调控。近年发现CK20只在胃肠道和尿路上皮中表达，核基质蛋白（NMP）对DNA的复制、转录以及基因表达的调节起着重要作用。我们采用RT-PCR法检测细胞角蛋白20（CK20）mRNA的表达，应用酶联免疫法（ELISA）测定尿路上皮癌中核基质蛋白22（NMP22）的水平，探讨其与尿路上皮癌的生物学行为的关系，现报告如下。

    1 资料与方法

    1.1 一般资料 对2001年12月～2002年6月我院收治的30例尿路上皮癌（26例移行细胞癌、2例鳞癌、1例腺癌、1例内翻性乳头状癌）及8例正常膀胱黏膜手术标本及尿液进行分析。男21例，女9例。年龄58～79岁，平均（64.3±17.4）岁。按世界卫生组织（WHO）病理分级:G1 4例，G2 12例，G3 14例；国际抗癌联盟（UICC）标准：浅表肿瘤14例（Ta～T1），浸润肿瘤16例（T2～T4）。

    1.2 CK20 mRNA的检测 所有手术标本于液氮冻存后，转至-80 ℃冰箱保存。采用美国Promega公司生产的RT-PCR试剂盒进行检测，CK20引物：Sense Primer:5’-CAG ACA CAC GGT GAA CTA TGG-3’，Antisense Primer:5’-GAT CAG CTT CCA CTG TTA GAC G-3’。GAPDH 引物：Sense Primer:5’-ATG GCA CCG TCA AGG CTG AG-3’ Antisense Primer:5’-CGC CTG CTT CAC CAC CTT CT-5’。PCR扩增条件为94 ℃ 2 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，35个循环。用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。

    1.3 NMP22的测定 留取患者晨起第一次尿液，应用Matritech公司生产的双抗体夹层ELISA方法测定尿路上皮癌患者尿液中的NMP22水平，建立ROC曲线，确定NMP22的临界值及诊断中敏感性和特异性的判断。

    1.4 统计学方法 用SPSS 10.0统计软件包对数据进行统计分析。采用卡方检验和等级资料秩和检验，组间比较使用等级资料Mann-Whitney U秩和检验，P<0.05被认为有统计学意义。

    2 结果

    2.1 CK20mRNA和NMP22在尿路上皮癌中的表达 CK20mRNA和NMP22的表达与尿路上皮癌密切相关。CK20mRNA的表达与移行细胞癌、腺癌和内翻性乳头状癌有明显的相关性（P<0.05），而在鳞癌中无表达，它与肿瘤数目的多少和肿瘤复发程度无关。NMP22的表达（以10.0 u/ml为临界值）在移行细胞癌、鳞癌和腺癌中有较强的表达，而在内翻性乳头状癌中表达较弱，多发肿瘤与单发肿瘤相比，差异有显著性意义（P<0.01），但与肿瘤的复发程度无关（P>0.05），见表1。CK20mRNA表达与肿瘤的病理分级、临床分期无明显相关性。NMP22的含量随着病理分级增高、临床分期的增加，而差异有显著性（P<0.01），见表2。

    2.2 尿NMP22测定在尿路上皮癌诊断中的价值 根据NMP22测定值做出ROC曲线，见图1，ROC曲线下面积为0.725，面积的标准误为0.052，尿NMP22用于诊断尿路上皮癌有显著性意义（P=0.0162），面积的95%可信区间为（0.624～0.826），不包括0.5。以10.0 u/ml为临界值。NMP22诊断尿路上皮癌的敏感性为63.5%，特异性为65.9%；阳性预测值为69.4%，阴性预测值为61.7%。

    2.3 CK20mRNA和NMP22表达在尿路上皮癌中的相互关系 从表3可以看出，在CK20阴性组中NMP22表达降低例数为50%，而在CK20阳性组中NMP22表达降低例数为96.4%，卡方检验，两组之间差异有显著性（P<0.01）。表1 CK20mRNA和NMP22在尿路上皮肿瘤中的表达 表2 尿路上皮癌中CK20mRNA和NMP22与病理分级、临床分期的关系

    3 讨论

    细胞角蛋白有角蛋白基因编码，是上皮细胞发生、分化、成熟过程中逐渐形成的细胞骨架中间丝成分，它包括至少20个成员。根据分子量和等电点的不同，可分为酸性角蛋白（CK9～20）和碱性角蛋白（CK1～8）。不同的角蛋白以不同的组合方式协同表达［1～3］。CK20由Moll等于1990年分离鉴定，并用免疫组化技术证明CK20只在胃肠道上皮细胞、尿路上皮表浅的伞状细胞及表皮Merkel细胞中表达。Klein等［4］认为CK20mRNA仅在尿路移行上皮细胞癌中表达，正常尿路移行上皮细胞则不表达；而CK19则在各种上皮均可表达，包括正常尿路上皮。本研究结果显示在30例膀胱上皮癌中，CK20mRNA的表达与膀胱移行细胞癌（TCC）有明显的相关性，但是在鳞癌中无表达，提示CK20mRNA是移行上皮癌的一个标志。但是它与尿路上皮癌的病理分级和临床分期无明显相关性，提示它与肿瘤的恶性度和浸润程度无关。尿细胞学检查是简单、经济的方法之一，Buchumensky等［5］运用RT-PCR法检测膀胱移行细胞癌患者尿液标本脱落细胞中CK20的表达，发现其敏感性较高，可达91%，但在各级别、各分期的肿瘤中表达无差别，表明CK20表达与肿瘤分级、分期无关。应用RT-PCR方法检测尿路移行上皮细胞癌患者尿脱落细胞CK20mRNA的表达是一种敏感的、无创的尿路上皮癌随访方法。但是也有不同的观点，认为尿中CK20的表达与肿瘤的分级密切相关，高级别肿瘤（Ⅲ，Ⅳ）的敏感性为100%，低级别肿瘤（Ⅰ，Ⅱ）敏感性为71%～80%。并认为高分级肿瘤由于细胞间黏附作用下降，因而尿路上皮更容易脱落；而低分级肿瘤或小的肿瘤由于尿液中的脱落细胞很少，加之尿液标本收集方法的影响，以至不足以检出［6］。因此，尿中CK20 mRNA的表达与肿瘤分级、分期的关系还有待更多的研究证实。CK20的表达也可以作为尿路上皮癌预后的一个指标，Rotem等［6］分析了11例有TCC病史但目前病理诊断为良性病变者（移行上皮化生6例、不典型增生2例、炎症3例）中9例CK20阳性，进一步随访6个月发现9例中有4例复发，提示CK20阳性与早期复发有关。应用RT-PCR方法检测尿路移行上皮细胞癌患者尿脱落细胞CK20mRNA的表达，是一种敏感的、无创的尿路上皮癌随访方法。所以CK20mRNA的表达与尿路上皮癌的发生、发展密切相关，是膀胱癌有潜在价值的肿瘤标记物，具有早期诊断和判断预后的价值，有广泛的研究和应用前景。

    核基质蛋白（NMP）是20世纪70年代中期发现的一种以细胞核RNA-蛋白质为骨架的三维网状结构蛋白，参与维持细胞核的结构和功能，对DNA的复制、转录，RNA合成，以及基因表达的调节起着重要作用，在肿瘤的形成中具有重要功能［7，8］。NMP随细胞复制的不同阶段不断发生变化，核基质成分也随着细胞转化和分化而出现或消失某些特异性蛋白。首先发现在体外培养的膀胱癌细胞株中，NMP22的浓度比正常膀胱移行上皮细胞至少高25倍，是尿路上皮特异性肿瘤标志物［9］。此后在乳腺、结肠、骨骼组织中也相继发现了特异性NMP的表达。NMP22在细胞凋亡后由细胞核释出，以可溶性复合物或片段的形式存在于尿中，利用特异性NMP22单克隆抗体免疫测定的方法可迅速、定量地检测尿中NMP22含量，用于膀胱癌的诊断和术后监测。本研究结果显示，NMP22的检测与膀胱癌密切相关，其表达程度随膀胱癌病理分级和临床分期的增高而升高，是膀胱癌浸润和复发的一个重要指标。病理分级和临床分期高的肿瘤由于肿瘤细胞间黏附力的降低，肿瘤组织更容易坏死、脱落，更容易被检出，所以NMP22的表达在一定程度上反映了肿瘤的恶性程度和预后。NMP22诊断膀胱癌的最适临界值与其敏感性密切相关。Soloway等［10］以10.0 u/ml作为肿瘤复发的参考值，敏感性为70%（其中浸润性肿瘤为100%），特异性为79%。但是也有学者以12.0 u/ml和6.0 u/ml作为参考值，也得出相似的结论［11，12］，所以现在关于NMP22的最适临界值没有一个明确的定义，目前大部分学者都以10.0 u/ml作为肿瘤复发的参考值进行研究。本实验根据NMP22测量结果建立ROC曲线，确定以10.0 u/ml为最适临界值，NMP22诊断膀胱癌的总体敏感性为63.5%（浸润性肿瘤为86.4%），特异性为65.9%。

    肿瘤具有异质性。正常细胞转化成癌细胞，癌细胞也可以由低级向高级别转化，甚至出现转移等现象，是受许多基因的调控，是一个多阶段和复杂的过程。膀胱癌的发生和发展同样是一个多基因、多因素、相互作用的分子水平的过程。本研究结果显示，CK20mRNA和NMP22表达在相互作用的关系上，随着肿瘤恶性程度的升高，二者同时增高，在肿瘤的表达上呈正相关，在肿瘤的发生和发展中起协调作用，共同参与了肿瘤的形成机制。所以我们认为，在对膀胱癌进行传统的病理分级、临床分期、尿脱落细胞学检查的基础上，同时进行多基因、多参数、多水平的检测，对更准确判断肿瘤的恶性程度，预测其浸润、复发和判断预后具有重要价值。

【参考文献】
  　　1 Abd EI，Gawad IA，Moussa HS，et al.Comparative study of NMP-22，Telomerase，and BTA in the Detection of Bladder Cancer.J Egypt Natl Canc Inst，2005，17（3）:193-202.

2 Kibar Y，Goktas S，Kilic S，et al.Prognostic value of cytology，nuclear matrix protein 22 （NMP22） test，and urinary bladder cancer II （UBC II） test in early recurrent transitional cell carcinoma of the bladder.Ann Clin Lab Sci，2006，36（1）:31-38.

3 Shariat SF，Zippe C，Ludecke G，et al.Nomograms including nuclear matrix protein 22 for prediction of disease recurrence and progression in patients with Ta，T1 or CIS transitional cell carcinoma of the bladder.J Urol，2005，173（5）:1518-1525.

4 Klein A，Zemer R，Buchumensky V，et al.Expression of cytokeratin 20 in urinary cytology of patients with bladder carcinoma.Cancer，1998，82:349-354.

5 Buchumensky V，Klein A，Zemer R，et al.Cytokeratin 20:a new marker for early detection of bladder cell carcinoma.J Urol，1998，160:1971-1974.

6 Rotem D，Cassel A，Lindenfeld N，et al.Urinary cytokeratin 20 as a marker for transitional cell carcinoma.Eur Urol，2000，37:601-604.

7 Berezney R.The nuclear matrix:a heuristic model for investigating genomic organization and function in the cell nucleus.J Cell Biochem，1991，47:109-123.

8 Dworetzky SI，Wright KL，Fey EG，et al.Sequence-specific DNA-binding proteins are components of a nuclear matrix-attachment site.Proc Natl Acad Sci，1992，89:4178-4182.

9 Keesee K，Brigmann JV，Thill G，et al.Utilization of nuclear matrix proteins for cancer diagnosis.CRC Crit Rev Eukaryotic Gene Expr，1996，6:189-214.

10 Soloway MS，Brigman JV，Carpinito GA，et al.Use of a new marker urinary NMP22 in the detection of occult or rapidly recurring transitional cell carcinoma of the urinary tract following surgical treatment.J Urol，1996，156:363-367.

11 Miyanaga N，Akaza H，Tsukamoto T，et al.Urinary nuclear matrix protein（NMP22）as a marker for screening urothelial cancer in patients with hematuria.Suppl J Urol，1998，159:243.

12 Carpinito GA，Rukstalis DB，Pandrangi LV，et al.Prospective，multi-center study of NMP22 and cytology in patients with hematuria.Suppl J Urol，1998，159:245.

（编辑：杨 熠）

作者单位：300052 天津，天津医科大学总医院泌尿外科