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【摘要】
目的 分析Survivin及其异构体Survivin-2B在膀胱癌组织中的表达，并探讨其潜在的临床意义。方法 用实时定量RT-PCR法检测56例膀胱癌患者的肿瘤组织（试验组）和12例膀胱非恶性肿瘤组织（对照组）中Survivin mRNA，Survivin-2B mRNA的表达情况。结果 对照组中有4例微量表达Survivin，12例均微量表达Survivin-2B；56例膀胱癌标本全部表达survivin和Survivin-2B。Survivin的表达量与膀胱癌的病理分级和浸润深度呈正相关（0.5 【关键词】 膀胱癌 Survivin；Survivin-2B 异构体 实时定量RT-PCR HE Xue-feng，WEN Duan-gai，HOU Jian-quan，et al.Department of Urology，the First Affiliated Hospital of Soochow University，Suzhou 215006，China ［Abstract］ Objective To investigate the expression of survivin mRNA and its isomer survivin-2B mRNA in bladder cancer and discuss its potential clinical significance.Methods Real-time quantitive RT-PCR was used to detect the expression of survivin mRNA，survivin-2B mRNA in 56 cases of bladder malignant tumor tissues and 12 cases of bladder nonmalignant tumor tissues.Results Microcrystalline expressions of survivin and survivin-2B were detected in 4 and 12 nonmalignant tumor tissues respectively.Survivin and survivin-2B expressions were detected in all malignant tumor tissues.Expression of survivin was correlated well with pathological grade and infiltration depth（0.5 ［Key words］ bladder cancer；survivin；survivin-2B;isomer;real-time quantitive RT-PCR Survivin是凋亡抑制蛋白家族IAPs（inhibitor of apoptosis proteins）中结构最简单，抗凋亡作用最强的蛋白分子，含有四个外显子和三个内含子，只含有一个杆状病毒IAP重复序列（baculoviral IAP repeats，BIRs），BIR结构主要起抗凋亡作用。Mahotka等在1999年鉴定出Survivin的一种异构体Survivin-2B，Survivin-2B添加了被隐含外显子2B编码的23个氨基酸，该外显子插入到Survivin的BIR区（外显子2和3之间）改变其三级结构及抗凋亡活性，在转染实验中发现Survivin-2B有明显降低抗凋亡的特性，并具有细胞 毒性［1，2］。本研究通过运用实时定量PCR法检测膀胱癌组织中Survivin mRNA及Survivin-2B mRNA的表达，并做定量分析，探讨它们在膀胱肿瘤发生、发展中的作用及临床意义。 1 对象与方法 1.1 研究对象 选取2006年6月～2007年9月手术切除的原发性膀胱癌患者新鲜标本56例，男36例，女20例，年龄46～82岁，平均64岁。取同期膀胱非恶性肿瘤患者的膀胱病变组织标本12例（慢性膀胱炎6例，腺性膀胱炎3例，内翻乳头状瘤3例）作为对照。标本均具有完整的病理资料。按WHO病理分级标准：Ⅰ级17例，Ⅱ级28例，Ⅲ级11例；浸润深度：未侵及肌层39例，侵及肌层17例。 1.2 RNA提取及逆转录反应 将标本剪至0.2 cm3左右大小，无菌生理盐水冲洗3次，吹打成匀浆，加Trizol试剂1 ml，一步法抽提RNA。逆转录反应共40 μl体系，包括六随机引物2 μl（上海生工公司），RNA 4 μl，DEPC水9 μl（BBI公司），5×Buffer 8 μl，MMLV 1.5 μl，Rnasin 0.5 μl（Promega公司），dNTP 0.5 μl，H2O 14.5 μl，37 ℃ 1 h，95 ℃ 5 min，最后冷却至4 ℃，保存于-20 ℃备用。 1.3 实时定量RT-PCR反应 以abl为内参，并设立空白对照。经内参均一化处理后，计算Survivin及Survivin-2B mRNA的相对表达量2-△Ct值。Survivin的上游引物：5′-TGCCTGGCAGCCCTTTC-3′，下游引物：5′-GCGCAGCCCTCCAAGAA-3′，survivin-2B［3］的上游引物：5′-GCACGGTGGCTTACGCCTG-3′下游引物： 5’-AACCGGACGAATGCTTTTTATGTTCC-3′，TaqMan探针序列：5′-FAM-CAAGGACCACCGCATCTCTACATT-CAAGA-TAMRA-3′。abl内参的上游引物：5′-TCCTCCAGCTGTTATCTGGAAGA-3′，下游引物：5′-ACTCAGACCCTGAGGCTCAAAG-3′，探针序列：5′-FAM-AAGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCAT-TAMRA-3′。反应条件：95 ℃ 5 min 预变性，95 ℃ 15 s，58 ℃ 25 s，72 ℃ 25 s，78 ℃ 0.1 s，60 ℃～96 ℃ 0.3 s融解曲线，72 ℃ 5 min，共50个循环。实验重复3次。 1.4 PCR产物纯化及测序 向膀胱肿瘤标本的Survivin-2B PCR产物中加入20 ml DP洗脱液，37 ℃放置2 min，离心回收DNA。将纯化后的DNA送至上海博亚公司进行测序。 1.5 统计学方法 Survivin、Survivin-2B相对于内参abl表达量2-△Ct值以均数±标准差（x±s）表示，独立组间均数比较用Wilcoxon秩和检验，试验组内部组间采用Kruskal-wallis H检验，并作Spearman秩相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。数据由SPSS 11.5软件包完成。 2 结果 2.1 试验组与对照组Survivin，Survivin-2B的表达量 对照组中有4例（病理证实均为慢性膀胱炎）微量表达Survivin，试验组全部表达Survivin；对照组、试验组均全部表达Survivin-2B。试验组与对照组的Survivin，Survivin-2B表达量差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。表1 对照组与试验组Survivin，Survivin-2B的相对表达量注：与对照组比较，试验组的Survivin及Survivin-2B的表达量，*P<0.05 2.2 试验组survivin，Survivin-2B在不同临床特征分组中的表达量 在不同性别和肿瘤单个、多个分组中，Survivin及Survivin-2B的表达量无明显差异（P>0.05）。Survivin的表达量在不同病理分级、不同浸润深度中差异显著（P<0.05），相关分析发现，与病理分级和浸润深度呈正相关（0.5 2.3 测序结果 取5例膀胱肿瘤标本的Survivin-2B PCR产物经测序证明为Survivin-2B异构体。 3 讨论 近期研究表明，抗凋亡基因Survivin表达于多种肿瘤组织。在膀胱癌患者的尿液以及肿瘤组织中均存在Survivin的表达，并发现其与膀胱癌的病理分级、临床分期密切相关，其表达量的增高预示了患者预后较差［4，5］。在体外实验中，利用小分子干扰RNA（siRNA）技术，可以明显促进T24膀胱癌细胞凋亡并抑制其增殖［6］。在裸鼠体内研究中，发现向其膀胱癌瘤体内注入靶向Survivin的siRNA，能明显抑制肿瘤生长［7］。这些均表明，Survivin在膀胱癌的发生、发展中具有重要作用，可以作为诊断和评估表2 试验组Survivin，Survivin-2B的相对表达量与不同临床特征之间的关系 注：Survivin及Survivin-2B的表达量在不同病理分级中差异有统计学意义，*P<0.05 预后的一个指标，并可能作为膀胱癌基因治疗的一个良好靶点。Survivin-2B是Survivin的外显子2和3剪接后产生的一种异构体，含有165个氨基酸，定位于核膜和线粒体，在胞浆中也存在其表达。不同的细胞类型Survivin-2B的线粒体定位点也不同，并认为Survivin-2B诱导细胞凋亡的一个可能机制是通过与定位在线粒体上的Survivin相互作用而阻碍其释放入胞质溶胶中［1］。最近研究已经证实了在一些肿瘤中存在Survivin-2B的表达，并发现其作用与Survivin可能完全不同。Suga等［8］用定量RT-PCR检测了Survivin、Survivin-2B在结肠癌标本和正常标本中的转录水平，结果显示它们在肿瘤标本中的表达较在正常组织中明显增高，而在肿瘤Ⅲ期和Ⅳ期Survivin-2B/Survivin的表达比率却要比在Ⅰ期和Ⅱ期中低，发现这种比率与肿瘤预后呈正相关，提示Survivin-2B在结肠癌进程中有负性作用。Troger等［9］发现在儿童前体B淋巴细胞白血病中，Survivin-2B表达降低与患病风险增高相关，认为Survivin-2B是Survivin的天然抵抗物，预示其可能作为癌症治疗的一个具有潜在价值的新靶点。 本试验应用实时定量RT-PCR同时定量检测了Survivin和Survivin-2B在膀胱癌组织中的表达，发现他们的表达量在实验组与对照组中均存在显著差异（P<0.05）。Survivin的表达量与膀胱癌的病理分级和浸润深度呈正相关，提示其表达量的增加预示患者的预后较差。笔者第一次用定量方法检测了Survivin-2B在膀胱癌中的表达，发现其表达量与肿瘤的病理分级和浸润深度呈负相关（-1 【参考文献】 作者单位：215006 江苏苏州，苏州大学附属第一医院泌尿外科（△通讯作者）
Expression and clinical significance on survivin and its isomer survivin-2B in bladder cancer
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