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【摘要】 目的 探讨FHIT和C-erbB-2在乳腺癌进展过程中的表达和意义。方法 用免疫组化S-P法检测105例乳腺癌，50例乳腺良性肿瘤；40例正常乳腺对照组织（取自乳腺良性肿瘤以外2 cm的乳腺组织）组织中FHIT蛋白、C-erbB-2蛋白的表达。结果 FHIT蛋白在乳腺癌组织中的阳性率明显低于正常乳腺组织或乳腺良性肿瘤,比较差异有统计学意义（P<0.05）。C-erbB-2在乳腺正常组织、乳腺良性肿瘤及乳腺癌组织中的阳性率分别为0（0/40）,20%（10/50）,和76.2%（80/105）,比较差异有统计学意义（P<0.05）;在乳腺肿瘤组织中,随组织学病理分级的增加、临床分期的进展和腋窝淋巴结的转移,FHIT蛋白表达阳性率逐渐下降, C-erbB-2表达强阳性率则逐渐上升,比较差异有统计学意义（P<0.05）;FHIT蛋白、C-erbB-2蛋白表达相关（P<0.001）。结论 FHIT、C-erbB-2在乳腺癌的发生、发展过程中起着重要的作用,联合检测可为乳腺癌的早期诊断、进一步治疗及预后判断提供必要的理论依据。
【关键词】 乳腺肿瘤 FHIT C-erbB-2 免疫组织化学
The expression and significance of FHIT,C-erbB-2 in progression of breast carcinoma
CHEN Zhou，WU Jun-hui.1st Department of Surgery in Yiyang Central Hospital,Yiyang 413000,China
［Abstract］ Objective To study the expression and significance of FHIT protein, C-erbB-2 protein in progression of breastcarcinoma.Methods Im-munohistochemical staining S-P method was used to detect the expression of FHIT protein, C-erbB-2protein in 105cases with breast carcinoma, 50 cases with breast benign and 40 cases normal mammary.Results The positive expression rate of FHIT protein in breast carcinoma was lower than that in normal breast （P<0.05）. the expressions rates of C-erbB-2 in the tissues of normal mammary, breast benign and breast carcinoma were 0（0/40）, 20%（10/50）and 76.2%（80/105） respectively,and there were statistical significance compared with each other （P<0.05）.With the increase of histological grade, clinic stage, lymphatic metasta-sis, the expression rate of FHIT was decreased, while the expression rate of Survivin was increased. Correlation was also found between FHIT and C-erbB-2 expressions.Conclusion FHIT and Survivin may play important roles in oncogenesis and progression of breast carcinoma. Detection of FHIT,Survivin protein may have potential effects on early diagnosis, treatment and prognosis of breast carcinoma.
［Key words］ breast neoplasms; FHIT; C-erbB-2; immunohistochemistry
脆性组氨酸三联体基因（fragile histidine triad gene,FHIT）是1996年Ohta等用定位克隆及外显子捕获技术在3p14·2首先克隆出来的,在多种肿瘤中,均有改变,以缺失为主。目前认为, FHIT基因是一个候选的抑癌基因。C-erbB-2已证实是一个与肿瘤侵袭行为相关的癌基因，C-erbB-2的蛋白表达与乳腺癌的组织学分级，临床肿瘤进展期及肿瘤腋淋巴结的转移等显著相关。笔者针对上述情况,应用免疫组化S-P法检测105例乳腺癌组织、乳腺良性肿瘤50例、正常乳腺对照组织40例中FHIT、C-erbB-2蛋白表达情况,探讨它们之间的内在关系及乳腺癌的发病机制,并为其临床诊断和治疗提供依据。
1 资料与方法
1.1 一般资料 选取中南大学湘雅医学院临床学院益阳市中心医院2005年1月～2006年9月有完整病例资料的乳腺癌、乳腺良性肿瘤及正常乳腺组织共195例，年龄17～78岁，均为女性，其中乳腺癌105例（高分化癌30例，中分化癌49例，低分化癌26例），乳腺良性肿瘤50例；正常乳腺对照组织（取自乳腺良性肿瘤以外2 cm的乳腺组织）40例。
1.2 方法 所有标本均采用10%甲醛固定,常规石蜡包埋切片、HE染色。鼠抗人-FHIT多克隆抗体（美国Zymed公司）、鼠抗人C-erbB-2多克隆抗体（武汉博士德生物制剂有限公司）,采用免疫组化S-P法,切片厚4 μm,行微波处理,一抗4 ℃过夜,DAB显色,以PBS缓冲液代替一抗作阴性对照。
1.3 结果判定 FHIT阳性反应定位于胞浆上，细胞浆染成棕黄色为阳性细胞；C-erbB-2阳性反应定位于胞膜上，胞膜染成棕黄色颗粒样为阳性细胞。每张切片观察5个具有代表性的高倍视野，计数500个细胞中的阳性细胞数,按阳性细胞所占的比例数进行分级：≤25%为（-），25%～50%为（+），51%～75%为（++），≥75%为（+++）。
1.4 统计学处理 数据用SPSS 12.0软件包处理。采用χ2检验、χ2趋势检验和Fisher确切概率法对数据进行分析。Spearman等级相关分析资料的相关性。
2 结果
2.1 FHIT蛋白在正常乳腺组织与乳腺肿瘤组织中的表达 三组免疫组化染色后计数结果见表1。FHIT在乳腺癌组中的阳性率为48.6%，在乳腺良性肿瘤组中的阳性率为80%，而在正常乳腺组中的阳性率为100%，差异有统计学意义（P<0.05）。
2.2 C-erbB-2蛋白在正常乳腺组织与乳腺肿瘤组织中的表达 三组免疫组化染色后计数结果见表2。C-erbB-2在乳腺癌组中的阳性率为76.2%，在乳腺良性肿瘤组中有一例表达阳性率20%，而在正常乳腺组不表达阳性率为0，差异有统计学意义（P<0.05）。
2.3 乳腺癌中FHIT，Ｃ-erbB-2的表达与乳腺癌分期、分级的关系 在浸润性乳腺癌组织中，随着组织学病理分级的增加，临床分期的进展和淋巴结的转移，FHIT蛋白表达阳性率逐渐下降，C-erbB-2蛋白表达阳性率则逐渐上升（表3、4）。表1 FHIT蛋白在正常乳腺组织、乳腺肿瘤组织中的表达表2 C-erbB-2蛋白在正常乳腺组织、乳腺肿瘤组织中的表达表3 乳腺癌FHIT，Ｃ-erbB-2蛋白的表达与乳腺癌分期的关系注：*趋势χ2=5.75，P=0.016；**趋势χ2=3.77，P=0.052表4 乳腺癌FHIT，Ｃ-erbB-2蛋白的表达与乳腺癌分级的关系注：*趋势χ2=4.12，P=0.042，**趋势χ2=11.046，P=0.001表5 乳腺癌FHIT，Ｃ-erbB-2蛋白表达的相互关系
2.4 乳腺癌FHIT蛋白与C-erbB-2蛋白表达的相关性 本实验中发现，根据C-erbB-2表达不同的分组中FHIT表达有显著性差异，C-erbB-2阴性组FHIT表达率高；C-erbB-2表达率越高，FHIT表达率愈低，Spearman 等级相关分析显示：乳腺癌组织中C-erbB-2和FHIT的表达呈负性相关（r=-0.34，P=0.001）。见表5。
3 讨论
3.1 FHIT与乳腺癌的关系 脆性组氨酸三联体基因（fragile histidine triad gene，FHIT）是一种抑癌基因。
本研究结果显示：FHIT基因存在于所有正常乳腺组织, 在乳腺良性肿瘤中有缺失，而在乳腺癌中缺失或部分表达，显著低于乳腺良性肿瘤和正常乳腺组。此结果提示：在正常乳腺对照组织、乳腺良性肿瘤和乳腺癌组织中FHIT蛋白表达在逐步下降，特别在乳腺癌组织中显著下降。认为FHIT蛋白缺失或部分表达是与乳腺癌发生发展过程密切相关的分子事件，并且早在良性肿瘤阶段，FHIT基因已有缺失。FHIT基因存在于所有正常乳腺组织，主要通过参与细胞周期的调控和凋亡发挥作用，可使细胞受阻于增殖周期的S期，并激活Caspase 8、Caspase 9引起Caspase酶介导的凋亡级联反应。正常乳腺细胞的增殖与凋亡共同维持细胞数量的动态平衡。乳腺肿瘤通过FHIT的缺失或部分表达，阻断凋亡通道，破坏细胞周期调控的精确性，从而保持肿瘤细胞的生长和增殖，因此认为乳腺肿瘤中FHIT基因缺失或部分表达对乳腺肿瘤的演变、恶性转化起重要作用。
许多肿瘤组织中存在有FHIT蛋白表达的降低或缺失［1～6］。Campiglio［7］在他们的一项研究中报道，约31%乳腺癌出现FHIT基因转录子丢失或异常。Zochbauer-Muller［8］于2001年报道约31%乳腺癌的FHIT基因出现过度甲基化。另有多项研究也发现约有50%的乳腺癌出现FHIT表达水平明显降低［9］。Maitra等［10］报道原发性乳腺癌中3p14.2区的缺失率为45%（20/45），癌前病变中为11%（5 /47）。乳腺癌细胞系中亦观察到FHIT基因缺失［11～13］。本组按乳腺癌分级、分期分组，进行比较表明：FHIT在乳腺癌中的缺失与组织分级、分期有明显相关性。FHIT基因缺失与乳腺癌组织的分化程度、临床分期、淋巴结转移等因素密切相关，说明FHIT基因缺失对乳腺癌的分子生物学行为有重要影响。认为FHIT的缺失对于乳腺癌的恶性程度和预后的估计有明显价值，可作为判断乳腺癌患者预后的有效指标。
3.2 C-erbB-2与乳腺癌的关系 C-erbB-2亦称HER-2u（人类表皮生长因子受体2）［14］，是一种原癌基因。
本研究结果显示，正常乳腺组织中无C-erbB-2蛋白阳性表达，良性肿瘤组有C-erbB-2蛋白阳性表达，而在乳腺癌中高表达，显著高于良性肿瘤组和正常乳腺组，此结果提示，在正常乳腺组织、乳腺良性肿瘤和乳腺癌组织中C-erbB-2蛋白表达在逐步升高，特别乳腺癌变后显著升高，认为C-erbB-2蛋白过度表达是与乳腺癌发生发展过程密切相关的分子事件，并且早在良性病变阶段C-erbB-2已被激活，表达出过量C-erbB-2蛋白。
在侵袭性乳腺癌中［15～22］,疾病早期即可发现C-erbB-2蛋白的过表达； C-erbB-2过度表达的乳腺癌侵袭力较阴性表达者强，肿瘤更易、更早出现转移；C-erbB-2基因高表达者,恶性度较高,复发率高,术后生存期短；而且C-erbB-2蛋白的表达与乳腺癌的临床分期也有密切的关系。本研究按乳腺癌分级、分期分组，进行比较表明：C-erbB-2在乳腺癌中的过度表达与组织分级、分期有明显相关性，也与淋巴结转移有明显的相关性，认为C-erbB-2蛋白的检测对乳腺癌恶性程度的预测有重要价值。C-erbB-2蛋白表达随乳腺癌分期的增加明显增加，认为C-erbB-2蛋白表达的强弱对于病情轻重的预测有明显价值。C-erbB-2蛋白阳性细胞率高的乳腺癌预示其分期可能较晚。我们乳腺癌分期的主要区别在肿块的大小，淋巴结转移与癌转移，因此推断C-erbB-2蛋白的活化与乳腺癌的侵袭转移密切相关，表达C-erbB-2蛋白阳性细胞率高的乳腺癌提示其侵袭性强，并提示该病例容易发生或已有癌的转移。
3.3 乳腺癌中FHIT与C-erbB-2的相互关系及临床意义
3.3.1 乳腺癌中FHIT与C-erbB-2的相互关系 乳腺癌中FHIT与C-erbB-2的相互关系国内外尚未见文献报道。如前所述，FHIT的缺失与C-erbB-2的过度表达都是乳腺癌发生发展的事件，都与乳腺癌演变有关，它们之间是否有着内在联系协同作用而导致乳腺组织的癌变？C-erbB-2原癌基因属于酪氨酸激酶Ⅰ型受体家族,是一种跨膜蛋白,由细胞外结合功能域、亲脂性的跨膜功能域、细胞内酪氨酸激酶功能域和一段调节性羧基末端构成。C-erbB-2参与了正常乳腺组织生长与发育的调节，正常情况下不会引起乳腺细胞癌变。病理状态下，C-erbB-2受体表达增多,细胞内酪氨酸激酶的蛋白活化增强,酪氨酸激酶自身磷酸化，信息通道活性提高，信息经细胞膜和细胞间质传至细胞核，激活基因，同时C-erbB-2的异二聚体大大减少了细胞内吞过程中的降解,促进C-erbB-2循环回到细胞膜，在细胞膜过度表达,加速了细胞的增殖，细胞过度增殖导致肿瘤形成和增长加快。研究表明，FHIT蛋白存在于细胞浆，是一种Ap3A水解酶,可分解Ap3A成为AMP、ADP,降低胞内Ap3A水平。而Ap3A为ATP类似物，能以底物方式提供磷酸基团从而提高蛋白激酶的活性。因此FHIT表达下降时Ap3A水平升高可增强生长信号传递途径,阻断抑癌途径或凋亡通道，导致肿瘤的发生。本研究提示，乳腺癌中FHIT蛋白与C-erbB-2蛋白的表达呈负相关，即乳腺癌中FHIT蛋白表达的缺失与C-erbB-2蛋白的表达增加呈正相关。结前所述，在病理状态下，C-erbB-2基因的激活需要细胞内酪氨酸激酶自身磷酸化，而FHIT蛋白表达下降时细胞内Ap3A水平升高能以底物方式提供磷酸基团。由此推测，在正常情况下C-erbB2基因处于非激活状态,参与细胞生长、分化的调节。而FHIT存在于大多数正常组织中。当受到某些致癌因素的作用后,信息由细胞膜上C-erbB-2蛋白传到细胞浆，使FHIT蛋白部分表达或缺失，以至Ap3A聚集，以底物方式提供磷酸基团使酪氨酸激酶磷酸化从而启动了C-erbB-2蛋白的表达，因此在研究中表现出乳腺癌组织中C-erbB-2蛋白的表达与FHIT蛋白的表达呈负相关。由此推测，C-erbB-2基因的激活需要胞浆中的FHIT的缺失，Ap3A聚集提供磷酸基团。FHIT蛋白的缺失与C-erbB-2蛋白的激活间的具体分子机制有待进一步研究。
3.3.2 乳腺癌中FHIT与C-erbB-2的临床意义 有研究表明，C-erbB-2癌基因蛋白过度表达者中,患者的5年生存率为28%,而C-erbB-2癌基因阴性者5年生存率为71%［23］，两者5年生存率有明显差异。淋巴结转移情况是判断乳腺癌患者预后的传统指标，研究发现，病例中淋巴结转移者，C-erbB-2阳性率显著增高，有淋巴结转移且C-erbB-2过度表达者5年生存率仅为3.3%，由此显示C-erbB-2过度表达是乳腺癌预后差的一个指标。C-erbB-2作为与乳腺癌分期、组织学分级密切相关的原癌基因,其意义已经明确，在乳腺癌危险度分级及指导治疗作用中已得到广泛应用。乳腺癌分子靶向治疗是指针对乳腺癌发生、发展有关的癌基因及其相关表达产物进行治疗。分子靶向药物通过阻断肿瘤细胞或相关细胞的信号转导，来控制细胞基因表达的改变，而抑制或杀死肿瘤细胞。赫赛汀（曲妥珠单抗，Trastuzumab, herceptin）是以Her-2为靶点的人源化单克隆抗体, 已成为乳腺癌治疗领域第一个分子靶向性药物,为临床治疗带来了新突破。其作用机制是与HER-2受体结合后干扰后者的自身磷酸化及阻碍异源二聚体形成，抑制信号传导系统的激活。FHIT作为较新的肿瘤抑制基因，在乳腺癌组织中其低表达与C-erbB-2高表达应当有同等意义：分化较差,侵袭性强，预后不良。研究表明,乳腺浸润性导管癌FHIT蛋白表达与导管内癌比较差异有统计学意义，乳腺癌伴淋巴结转移组FHIT蛋白表达率与未伴淋巴结转移组比较差异有显著性；提示FHIT蛋白低表达与乳腺癌的侵袭、转移相关。FHIT基因异常、FHIT蛋白低表达均与乳腺癌进展相关；FHIT的低表达与乳腺癌患者无病生存率及其他多项临床病理指标显著相关［24］；FHIT蛋白用免疫组化方法易于检测，因此可能成为一种新的预后分子指标用于临床监测患者预后。本实验中可看到,在原癌蛋白C-erbB-2高表达的病理组织中,同时存在着抑癌基因FHIT低表达的趋势。联合检测乳腺肿瘤组织中FHIT蛋白，C-erbB-2蛋白的异常表达，有助于对肿瘤恶性程度、侵袭性，及预后做出正确的评价。
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作者单位：413000 湖南益阳，益阳市中心医院普外一科