全脑缺血-再灌注对海马CA1区GAD65表达的影响及意义*

【摘要】  目的 探讨全脑缺血-再灌注对成年大鼠海马CA1区GAD65表达的影响及意义。方法 成年雄性SD大鼠24 只，随机分为3组：假手术组（SH）、缺血-再灌注3天组 （IR-3） 及缺血-再灌注7天组（IR-7），每组8只。采用四动脉阻断法制作全脑缺血-再灌注模型，应用免疫组织化学方法检测海马CA1区谷氨酸脱羧酶（glutamic acid decarboxylase，GAD）同工酶GAD65的表达变化。结果 与假手术组相比，IR-3组GAD65的表达明显增多，IR-7组恢复正常。结论 GABA能中间神经元对缺血相对耐受；全脑缺血-再灌注3天，GAD65的表达增多可能是一种代偿性的机制，以减轻脑缺血后的高兴奋性。

【关键词】  脑缺血；再灌注；谷氨酸脱羧酶；海马；大鼠

    Effect of global ischemia-reperfusion on expression of GAD65 in hippocampal CA1 region

    XU Lin-feng，MA Wen-pei，LIU Jing，et al.Department of Neurology,No.2 Affiliated Hospital of Kunming Medical College,Kunming 650101,China

    ［Abstract］  Objective  To observe the effect of cerebral ischemia-reperfusion on the expression of GAD65 in the hippocampal CA1 region of adult rats.Methods  24 male SD rats were randomly divided into three groups:sham operation group （SH，n=8），ischemia-reperfusion 3 days （IR-3，n=8） and 7 days group （IR-7，n=8）。cerebral ischemic episode was achieved by 4-artery occlusion．Immunohistochemical method was applied to observe the expression of GAD65 in hippocampal CA1 region.Results  At IR-3，the immunoreactivities of the GAD65 were markedly elevated in the CA1 region，compared with SH group.At IR-7，their immunoreactivities recovered at the mal level.Conclusion  GABA interneurons relatively resist ischemia-reperfusion injury，and the increasing expression of GAD65 in 3 d after ischemia-reperfusion can be a compensatory mechanism to reduce the hyperexcitability associated with ischemia-reperfusion.

    ［Key words］  brain ischemia; reperfusion; glutamate decarboxylase; hippocampus; rat

    γ-氨基丁酸（γ- Aminobutyric Acid，GABA）是哺乳类动物中枢神经系统中最重要的一种抑制性氨基酸（inhibitory amino acid，IAA）递质［1］，GABA能的抑制作用在调控谷氨酸能突触的活动中起着重要的作用。因此，GABA能系统的异常可以导致神经元的高兴奋性，从而导致再灌注损伤。因而研究脑缺血后GABA功能的变化，对脑缺血的治疗有重要的指导意义。本研究通过建立全脑缺血-再灌注动物模型，探讨成年大鼠海马CA1区GAD65的表达变化及意义。

    1  材料与方法

    11  实验动物及分组  24只雄性SD大鼠，体重200~250g（昆明医学院实验动物中心提供），随机分为3组：假手术组（SH）、缺血再灌注3天组（IR-3） 和缺血再灌注7天组（IR-7）各8只。

    12  全脑缺血-再灌注模型制备  采用四血管阻断法制作全脑缺血（10 min）-再灌注动物模型。以04%戊巴比妥钠（40 mg／kg）腹腔注射麻醉后，从后颈部正中纵向切开皮肤，分离椎旁肌，暴露第一颈椎翼状孔，电灼烧凝固双侧椎动脉，造成永久性关闭。再从颈前正中纵向切开皮肤，分离双侧颈总动脉，分别用丝线绕过双侧颈总动脉，将丝线的另一端置于皮肤切口外，不完全缝合皮肤切口以备次日用。24 h后用留置丝线将双侧颈总动脉由皮肤切口牵出，用动脉夹夹闭双侧颈总动脉10 min后再通。术中及术后保持肛温37 ℃。模型成功标准：1 min内昏迷，双侧瞳孔放大，翻正反射消失。假手术组仅暴露双侧颈总动脉和翼小孔，不做缺血处理。采用四血管阻断法，制作大鼠全脑缺血（10 min）再灌注模型。模型成功标准：（1）翻正反射消失；（2）呼吸加快，竖毛，眼发白。术中及术后保持肛温37 ℃。

    13  标本取材及制作脑组织切片  假手术组在再灌注后24 h，实验组在再灌注后相应时间点经04%戊巴比妥钠（40 mg／kg）腹腔注射麻醉后，先后用生理盐水及4%多聚甲醛150 ml常规灌注固定，断头取脑放入4%多聚甲醛，4 ℃冰箱内过夜，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋及切片。

    14  免疫组织化学染色  采用ABC法进行免疫组织化学染色，胞浆呈棕褐色为GAD65阳性反应神经元。GAD65多克隆抗体购于武汉博士德生物工程有限公司。

    15  GAD65光密度值测定  采用HPIAS-1000高清晰彩色病理图像分析系统，测定每张切片GAD65免疫组织化学染色的光密度值，每张切片于海马CA1区随机选取5个视野分别进行测定，取其均数作为结果。

    16  统计学方法  应用SPSS 100版软件进行统计分析，资料以均数±标准差（x±s）表示，进行单因素方差分析。

    2  结果

    与假手术组（SH，1089±30）相比：GAD65的光密度值在缺血再灌注后3天（is3天，1196±37，P<005）显著性增高；再灌注后7天（is7天，1031±31，P>005）差异无统计学意义（见图1）。

    3  讨论

    海马CA1区锥体细胞是对脑缺血最为敏感的细胞之一。在海马CA1区，锥体细胞受多重GABA能神经元支配，突触前GABA能中间神经元与突触后的锥体细胞形成多个抑制性突触联系。GABA由GABA能中间神经元释放入突触间隙后，通过与GABA受体相结合，介导抑制性突触后电流（IPSC）的产生，对谷氨酸等兴奋性氨基酸的“兴奋毒”作用  注：与SH组相比，*P<005表达的影响（光密度值）

    具有直接的对抗作用［2］。在成年动物，GABA发挥保护作用主要是通过激活GABAA受体，增加Cl-的内流，从而导致突触后膜的超极化来实现的。

    GABA在GABA能中间神经元内由谷氨酸在谷氨酸脱羧酶的催化下脱羧生成。GAD有两种同工酶：GAD65和 GAD67。他们的分子量分别为65 KD和67 KD，均以磷酸吡多醛（VitB6）作为辅酶。新生儿可以因为缺少VitB6，GABA合成减少而发生癫痫［3］。其中，GAD65位于神经末梢，与突触囊膜相结合，主要作用在于调控突触部位的GABA合成［4］与释放［5］，因而在GABA能突触传递中起着关键的作用［6］。

    本实验发现，缺血再灌注3天，GAD65的表达明显增多，再灌注7天恢复正常。在脑内，合成GABA的前体物质——谷氨酸的含量丰富，因此，GAD的活性可调节GABA的合成速度和GABA的含量，其分布与GABA能神经元又大多一致，所以，GAD是GABA能神经元极好的标志酶［3］。常通过测定脑组织GAD活性或GAD阳性神经元的数量、形态来反映中枢神经系统GABA能神经元的功能状态［7］。因此，本实验结果一方面支持了GABA能中间神经元更能对抗脑缺血的损害［8］，而缺血再灌注3天时，GABA能中间神经元的功能代偿性增强，通过GAD65的表达增多来增加突触末梢GABA的合成和释放从而使抑制性突触功能增强，降低脑缺血后的高兴奋性，从而减轻锥体细胞的损伤。因而，此时GAD65的表达增多是一种代偿性的机制，以对抗缺血后的兴奋性毒性。

    4  小结

    GABA能中间神经元对缺血相对耐受，并且再灌注3天时功能代偿性增强，通过增加GAD65的表达来对抗脑缺血后的高兴奋性，但这种代偿作用在再灌注7天时消失。

【参考文献】
  1 Frahm C，Haupt C,Witte OW.GABA neurons survive focal ischemic injury.Neuroscience，2004，127(2):341-346.

2 Matsumoto N，Kumamoto N，Furue H，et al.GABA-mediated inhibition of glutamate release during ischemia in substantia gelatinosa of the adult rat.Neurophysiol，2003，89（11）:257-264.

3 关新民.医学神经生物学.北京：人民卫生出版社，2002，125.

4 Kang TC，Park SK，Hwang IK，et al.Spatial and temporal alterations in the GABA shunt in the gerbil hippocampus following transient ischemia.Brain Res，2002，944（1-2）:10-18.

5 Namchuk M，Lindsay L，Turck CW，et al.Phosphorylation of serine residues 3，6，10，and 13 distinguishes membrane anchored from soluble glutamic acid decarboxylase 65 and is restricted to glutamic acid decarboxylase 65alpha.Biol Chem，1997，272（3）:1548-1557.

6 Kaufman DL，Houser CR，Tobin AJ.Two forms of the gamma-aminobutyric acid synthetic enzyme glutamate decarboxylase have distinct intraneuronal distributions and cofactor interactions.J Neurochem，1991，56（2）:720-723.

7 Benson DL，Huntsman MM，Jones EG.Activity-dependentchanges in GAD and preprotachykininm RNA in visual cortexof a dult monkeys.Cereb Cortex，1994，4(1):40-51.

8 Kobayashi M，Wen X，Buckmaster PS.Reduced inhibition and increased output of layer Ⅱ neurons in the medial entorhinal cortex in a model of temporal lobe epilepsy.J Neurosci，2003，23（24）:8471-8479.

作者单位：650101 云南昆明，昆明医学院第二附属医院神经外科