点击显示 收起
【摘要】 目的 通过研究口腔黏膜凋亡率和肠黏膜通透性指标(D -乳酸)之间的关系，探讨口腔黏膜凋亡率作为术后肠黏膜屏障功能的一个评价指标的可行性。方法 选择（250±20）g雄性SD大鼠60只，随机分为术前组、手术组并建立胃大部切除模型。用亚G1峰法检测大鼠口腔黏膜细胞凋亡率，按各时间点同步检测大鼠血中D -乳酸含量，对计量资料进行方差分析和相关性分析及显著性检验。分析手术前后不同营养状态下，口腔与肠道黏膜细胞凋亡率的相关性。结果 术后可观察到口腔黏膜细胞凋亡率术前和术后第1、3、5、7天的差异有统计学意义（P<0.05）；至10 日后才逐渐恢复到术前的水平。D-乳酸浓度术前和术后第3、5、7天差异有统计学意义（P<0.05），术后第1天、第10天与术前差异无统计学意义。结果证明口腔黏膜细胞凋亡率与肠黏膜屏障功能密切相关。结论 口腔黏膜凋亡率变化较D-乳酸浓度变化提前约48～72 h,口腔黏膜凋亡率与肠黏膜屏障功能状态之间有密切的关系，并较其指标灵敏，有希望成为一种无创、准确、灵敏的肠黏膜屏障功能指标。
【关键词】 口腔黏膜细胞;细胞凋亡；D -乳酸；肠黏膜屏障功能
Relationship of oral mucosa cell apoptosis and intestinal mucosal barrier function in rats by nutritional status
FENG Yu,HUANG Jian-ping,HU Jun-bo,et al.Department of Surgery, Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,Shanghai 201203,China
［Abstract］ Objective To investigate of the relationship between oral mucosa epithelial apoptosis rate and the intestinal mucosal barrier function in rats with the nutritional status.We attempted to evaluate the evaluation index of the intestinal mucosal barrier function by oral mucosa epithelial apoptosis rate.Methods Subtotal gastrectomy was performed in sixty male sprague-dawley rats, the rats were divided randomly into two groups: non-operation group and operation group.The oral and the intestinal mucosa epithelial apoptosis rate were measured by the flow cytometry.The intestinal mucosal permeability (plasma level of D-lactic acid) on the 1st day before operation and everyday after operation were measured.The statistical significance was decided by analysis of variance and q-test.Results There was significant different on oral mucosa epithelial apoptosis rate between the day before operation and 1st,3rd,5th,7th day after operation（P<0.05）.After 10 days, it gradually rised（P<0.05）.Compared with the apoptosis, the plasma level of D-lactic acid had a significant difference between the day before operation and the 3rd,5th,7th day after operation.There was a significant correlation between the oral mucosa cell' apoptosis rate and the intestinal mucosal barrier function by the nutritional status.Conclusion The oral mucosa epithelial apoptosis rate could be a new index to evaluate the body's nutritional assessment and the intestinal mucosal barrier function.
［Key words］ oral mucosal epithelia;apoptosis;D-lactic acid;intestinal mucosal barrier function
凋亡，或程序性细胞死亡，是被诱导分子和阻遏分子控制的一个主动的细胞死亡过程，是细胞周期中的一个主动耗能事件，为细胞生命过程中不可缺少的组成部分,是机体维持衡定状态所必需。作为体内更新最迅速的小肠上皮细胞,其细胞周期仅12 h,同样也存在着细胞凋亡［1］。正常情况下凋亡稳定在一个低水平状态,以维持绒毛的结构和功能。机体处于手术等急性蛋白质-热量营养不良状态下会出现小肠黏膜细胞凋亡率的波动。口腔及肠道黏膜细胞是同一胚胎层发育而来的不同部位的消化道上皮细胞，更新速度较快［2，3］，在相同营养不良状态下，两者黏膜凋亡率具有明显的相关性，故可通过口腔细胞凋亡率来反映肠道细胞代谢情况。
小肠上皮的增殖与凋亡和肠黏膜屏障功能之间的关系,近年来少有报道,在术后营养不良状态下, 小肠上皮的凋亡率降低而肠黏膜通透性增加,细菌易位现象增多。目前认为，正常肠道屏障功能的维持依赖于肠黏膜上皮屏障、肠道免疫系统、肠道内正常菌群、肠道内分泌及蠕动，其中最关键的屏障是肠黏膜上皮屏障和肠道黏膜免疫屏障［4］。当营养不良时，为细胞的各种生命活动提供能源的营养底物匮乏，从而使消化系统黏膜上皮的新陈代谢及凋亡率下降，同时肠黏膜屏障功能也出现明显降低。细胞是代谢活动的最基本单位，高速更新的组织中，细胞必然需要不断地合成DNA、RNA和蛋白质，需要持续地补充供蛋白质合成所需的原料，从而才能满足细胞的生长繁殖和代谢。代谢底物供给不足会直接影响细胞的状态。因此，检测细胞状态将能更直接的反映肠黏膜屏障功能状态。这就使得我们有可能使用一种细胞生物学的方法来对肠黏膜屏障功能进行评价。
1 材料与方法
1.1 实验动物 SD 大鼠由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供，动物合格证号：鄂2004-0007，雄性，体重200～250 g，购回后在我实验室动物房喂养3～5天。
1.2 实验方法
1.2.1 动物分组及胃大部切除模型的制作 将喂养3～5天后的大鼠随机分为手术组和术前组。具体分组情况见表1。胃大部切除模型的建立，术前禁食12 h，采用6％ 水和氯醛（0.5 ml/kg）腹腔注射麻醉，常规消毒手术区后作腹部正中切口进腹，作胃大部切除术，切除约2/3，并做成管状胃。逐层缝合关腹。
1.2.2 口腔黏膜细胞的收集和处理 按表1 各时间点，采用6％水和氯醛（0.5 ml/kg）腹腔注射麻醉，处死大鼠，并剥取大鼠口腔黏膜上皮。用生理盐水冲洗后，用医用棉签在黏膜表面反复擦拭后，放入约15 ml生理盐水中轻微震荡，以500目筛网过滤，滤液经800 r/min离心5 min，弃上清后以-20 ℃乙醇固定。
1.2.3 血样本收集 按表1 各时间点，各组大鼠分别取尾静脉血1.5 ml加入抗凝管内， 4 ℃下1 500 r/min，离心20 min， 取血浆-70 ℃冰箱保存， 统一检测。
1.2.4 D-乳酸测定 血浆经高氯酸去蛋白后，用酶耦联紫外分光光度法检测血浆D-乳酸。
1.2.5 口腔黏膜凋亡率的检测 取已固定口腔黏膜细胞800 r/min离心5 min弃上清，细胞用PBS洗涤两次，随后于80 μl PC缓冲液中冰上孵育30 min。PBS洗涤细胞，用10 μg/ml 碘化丙啶（PI）和0.1%RnaseA（Sigma公司）在室温下避光DNA染色20 min，经上述处理过的细胞用FACSort流式细胞仪（Becton Dickson）进行检测。经488 nm激光激发，被标记细胞发射红色荧光（PI），被FACSort流式细胞仪透镜接收。然后应用Cellquest软件对上述所测细胞的荧光强度进行分析。检测方法为Gong等建立的亚G1峰法［5,6］。表1 分组及各时间点分配情况
1.3 统计学方法 所有计量数据以均数±标准差（x±s）表示，采用SPSS 10.0医用统计程序对计量资料进行方差分析和相关性分析及显著性检验。以P＜0.05表示差异有统计学意义，P＜0.01表示差异有显著统计学意义。
2 结果
2.1 Sub-G1法测口腔黏膜细胞凋亡率 见图1。
2.2 口腔黏膜凋亡率的方差分析 见表2。
2.3 血中D-乳酸浓度变化 见表3。表2，表3中口腔、肠道黏膜凋亡率结果经统计学处理后用（x±s）表示，资料的方差分析方法用SNK检验数法(q检验)，进行统计分析。 注：横轴为细胞核DNA染色的荧光强度，纵轴为细胞计数 表2 口腔黏膜凋亡率注：术前：术前3天凋亡率取其平均值；与术前比较差异有统计学意义，△P<0.05；与术后10天比较差异有统计学意义，*P<0.05 表3 血液中D-乳酸浓度变化 注：术前：术前3天凋亡率取其平均值；与术前比较差异有统计学意义，△P<0.05；与术后10天比较差异有统计学意义，*P<0.05
术前和术后第10天与术后第1、3、5、7天口腔黏膜凋亡率的差异有统计学意义（P<0.05）； 术后10天与术前差异没有统计学意义。D-乳酸浓度术前和术后第10天与术后第3、5、7天差异有统计学意义（P<0.05），术后第1天、第10天与术前差异没有统计学意义。由此可见术后口腔黏膜的凋亡率明显下降，第3天下降至最低，然后逐渐上升，至10天后才逐渐恢复到术前的水平；而D-乳酸浓度术后当天及术后第1天无明显变化，术后第2天出现明显上升，第7天达到最高峰，以后逐渐下降，10天以后逐渐恢复到术前的水平。说明口腔黏膜凋亡率变化较D-乳酸浓度变化提前约48～72 h。见图2。注：天数为术后天数
3 讨论
细胞的凋亡与细胞的增殖、分化是细胞的基本生命活动，受到一系列复杂基因群的严格调控、密切相关。在多细胞生物体，特定组织器官的细胞类型和细胞数量是相对恒定的，维持器官特定的细胞数目是一个被严密调节的过程，这主要取决于细胞增殖和凋亡之间的动态平衡。凋亡或程序性细胞死亡，是被诱导分子和阻遏分子控制的一个主动的细胞死亡过程，是细胞周期中的一个主动耗能事件，为细胞生命过程中不可缺少的组成部分,是机体维持衡定状态所必需。作为体内更新最迅速的小肠上皮细胞,其细胞周期仅12 h,同样也存在着细胞凋亡［1］。正常情况下凋亡稳定在一个低水平状态,以维持绒毛的结构和功能。机体处于手术等急性蛋白质-热量营养不良状态下，维持各组织细胞正常增殖的营养底物减少，将导致组织细胞的细胞周期发生变化，对这种改变在新陈代谢最旺盛的组织的细胞最为敏感［7］。口腔及肠道黏膜细胞是同一胚胎层发育而来的不同部位的消化道上皮细胞，更新速度较快［2，3］，在相同营养不良状态下，两者黏膜凋亡率具有明显的相关性，而口腔黏膜细胞因临床上的易取性、无创伤性，故可通过口腔细胞凋亡率来反映肠道细胞代谢情况。
目前认为，正常肠道屏障功能的维持依赖于肠黏膜上皮屏障、肠道免疫系统、肠道内正常菌群、肠道内分泌及蠕动，其中最关键的屏障是肠黏膜上皮屏障和肠道黏膜免疫屏障［4］。D-乳酸是肠道细菌代谢、裂解的产物。在通常情况下，血浆D-乳酸水平很低，而哺乳动物组织既不产生D-乳酸，也不能或仅能缓慢代谢D-乳酸。当肠黏膜生物屏障破坏时，肠道中细菌产生的大量D-乳酸透过受损的肠黏膜经循环进入血液，故检测血浆D-乳酸水平，可以及时反映肠黏膜损伤的程度和通透性变化［8］。
鉴于外科住院患者中发生营养不良的约占患者总数的30%～42%［9～16］，蛋白质-热量营养不良是最常见的类型，不仅限于肿瘤患者而且在其他病种中亦广泛存在。营养不良会导致许多严重的并发症，如：并发症和死亡率增加，使患者住院时间延长，医疗费用增加，生活质量下降［17～29］。我们研究在手术等急性蛋白质-热量营养不良状态下，小肠上皮的增殖与凋亡和肠黏膜屏障功能之间的关系,本实验发现，术后口腔黏膜的凋亡率初期即明显下降，第3天下降至最低，然后逐渐上升，至10天后才逐渐恢复到术前的水平；而D-乳酸浓度术后当天及术后第1天无明显变化，术后第2天出现明显上升，第7天达到最高峰，以后逐渐下降，10天以后逐渐恢复到术前的水平。说明首先由于手术、应激、负氮状态、禁食等因素的影响，导致机体术后早期进入一个高分解代谢阶段，出现短期的急性蛋白质热量型营养不良，与此同时口腔黏膜细胞凋亡率作为一灵敏的反映营养状态指标立即出现明显的下降。随着能量的补充及逐步的进食恢复，以及应激因素的消失,机体的营养不良状况得到扭转。而肠黏膜屏障主要依赖于肠黏膜上皮屏障的完整、肠道免疫系统的发挥作用，当营养不良时，为细胞的各种生命活动提供能源的营养底物匮乏，从而使消化系统黏膜上皮的新陈代谢及凋亡率下降，细胞更新出现障碍，肠黏膜生物屏障的完整性受到了破坏，肠黏膜通透性增大，肠道中细菌产生的大量D-乳酸透过受损的肠黏膜经循环进入血液，故检测血浆D-乳酸水平随后出现明显升高，但较口腔黏膜细胞凋亡率变化要滞后48～72 h。
细胞是代谢活动的最基本单位，高速度更新的组织中，细胞必然需要不断地合成DNA、RNA和蛋白质，需要持续地补充供蛋白质合成所需的原料，从而才能满足细胞的生长繁殖和代谢。代谢底物供给不足会直接影响细胞的状态。因此，检测细胞状态将能更直接的反映肠黏膜屏障功能状态。在第一部分中，我们已经证实：口腔、肠道黏膜凋亡率均受到人体营养状态的影响，它们之间有密切的相关性。从我们的实验结果来看，在受到手术打击等急性蛋白质-热量营养不良状态下，口腔黏膜凋亡率较肠黏膜屏障功能受损要更早出现变化，更灵敏，这就使得我们有可能使用一种细胞生物学的方法来对肠黏膜屏障功能进行评价，同时在临床上对肠黏膜屏障功能受损起到一定的预警作用。
结论:口腔黏膜凋亡率与肠黏膜屏障功能之间有密切的联系，有希望成为一种无创的,灵敏的反映肠黏膜代谢状况，监测肠黏膜屏障功能状态的临床指标。
【参考文献】
1 Potten CS.A comprehensive study of the radiobiological response of the murine(BDFl) small intestine.Int J Radiat Biol,1990,58(6) :925.
2 Squier CA, Kremer MJ.Biology of oral mucosa and esophagus.J Natl Cancer Inst Monogr，2001，(29):7-15.
3 Rowat JS, Squier CA.Rates of epithelial cell proliferation in the oral mucosa and skin of the tamarin monkey (Saguinus fuscicollis).J Dent Res，1986，65(11):1326-1331.
4 王峰，赵瑛.D-乳酸与肠道屏障功能.临床和实验医学杂志,2006，（4）：127-128.
5 Gong JP，Traganos F，Darzynkiewicz Z.A selective procedure for DNA extraction from apoptotic cells applicable for gel electrophoresis and flow cytometry.Anal Biochem, 1994, 218: 314-319.
6 舒丹, 陶德定,龚建平.流式细胞术的亚G1峰法分析细胞凋亡的重新评价.中华实验外科杂志,2000，17(1):59-60.
7 蒋朱明，蔡威.临床肠内与肠外营养.北京: 科学技术文献出版社, 2000，174-175,344-349.
8 Johnston SD,Smye M, Watson RP.Intestinal permeability tests in celiac disease.Clin Lab,2001,47(3-4):143-150.
9 Agradi E, Messina V, Campanella G,et al.Hospital malnutrition: incidence and prospective evaluation of general medical patients during hospitalization.Acta Vitaminol Enzymol，1984，6:235-242.
10 Weinsier RL, Hunker EM, Krumdieck CL,et al.Hospital malnutrition: a prospective evaluation of general medical patients during the course of hospitalization.Am J Clin Nutr，1979，32:418-342.
11 Hill GL, Pickford I, Young GA,et al.Malnutrition in surgical patients: an unrecognized problem.Lancet，1977，1:689-692.
12 Bistrian BR, Blackburn GL, Hallowell E,et al.Protein status of general surgical patients.JAMA，1974，230:858-860.
13 Bistrian BR, Blackburn GL, Vitale J,et al.Prevalence of malnutrition in general medical patients.JAMA，1976，235:1567-1570.
14 Sullivan DH, Moriarty MS, Chernoff R,et al.Patterns of care: an analysis of the quality of nutritional care routinely provided to elderly hospitalized veterans.JPEN，1989，13:249-254.
15 Messner RL, Stephens N, Wheeler WE,et al.Effect of admission nutritional status on length of hospital stay.Gastenterol Nurs，1991，13(4):202-205.
16 Mowe M, Bohmer T.The prevalence of undiagosed protein-calorie undernutrition in a population of hospitalized elderly patients.J Am Geriatr Soc，1991，39:1089-1092.
17 Myers SA, Takigucki S, Slavish S,et al.Consistent wound care and nutritional support in treatment.Decubitus，1990，3(3):16-28.
18 Reilly JJ, Hull SF, Albert N,et al.Economic impact of malnutrition: a model system for hospitalized patients.JPEN，1988，11:371-376.
19 Detsky AS, Smalley PS, Chang J.Is this patient malnourished? JAMA，1994，271:54-58.
20 Sullivan DH, Walls RC.Impact of nutritional status on morbidity in a population of geriatric rehabilitation patients.J Am Geriatr Soc，1994，42:471-477.
21 Weinsier RL, Hunker EM, Krumdieck CL,et al.Hospital malnutrition: a prospective evaluation of general medical patients during the course of hospitalization.Am J Clin Nutr，1979，32:418-442.
22 Coats KG, Morgan SL, Bartolucci AA,et al.Hospital-associated malnutrition: a reevaluation 12 years later.J Am Diet Assoc，1993，93:27-33.
23 Walesby RK, Goode AW, Spinks TJ,et al.Nutritional status of patients requiring cardiac surgery.J Thorac Cardiovasc Surg，1979，77:570-576.
24 Seltzer MH, Slocum BA, Cataldi-Betcher EL,et al.Instant nutritional assessment: absolute weight loss and surgical mortality.JPEN，1982，6:218-221.
25 Seltzer MH, Fletcher HS, Slocum BA,et al.Instant nutritional assessment in the intensive care unit.JPEN，1981，5:70-72.
26 Mughal MM, Meguid MM.The effect of nutritional status on morbidity after elective surgery for benign gastrointestinal disease.JPEN，1987，11:140-143.
27 Meguid MM, Mughal MM, Debonis D,et al.Influence of nutritional status on the resumption of adequate food intake in patients recovering from colorectal cancer operations.Surg Clin North Am，1986，66:1167-1176.
28 Omram ML, John E，Morley MB，et al.Assessment of protein energy malnutrition in older persons, Part II: Laboratory evaluation.Nutrition，2000，16(2):131-140.
29 Kondrup J,Allison SP,Elia M,et al.ESPEN guidelines for nutrition screening 2002.Clin Nutr，2003,22(4):415-421.
作者单位：201203 上海，上海市中医药大学附属曙光医院普外科