HCN4基因在风心二狭心房纤颤患者心房组织中mRNA表达初探*

【摘要】  目的 通过分析风湿性心脏病二尖瓣狭窄患者心房肌组织HCN4基因表达与心房颤动发生的关系，为风心二狭房颤发生机制奠定理论基础。方法 取手术患者心耳组织100 mg，提取RNA后应用半定量逆转录－PCR方法检测mRNA含量，并对PCR产物测序分析。以HCN4基因mRNA和内参β-actin含量的比值作为评价HCN4基因mRNA表达水平指标。结果 测定HCN4基因cDNA 序列同源性为100%。试验组及对照组HCN4基因mRNA与β-actin含量的相对表达值比值（±s）分别为0.696±0.257和0.125±0.010，两组比较，差异有显著性(P<0.01）。结论 HCN4基因的过度转录表达可能参与了调控风心二狭房颤的发生过程，揭示了HCN4基因作用的分子机制。

【关键词】  HCN4基因；风心二狭；心房纤颤；序列测定

    Increased atrial expression of HCN4 gene mRNA in atrial fibrillation patients with mitral stenosis of rheumatic heart disease

    ZHOU Hua-fu，YANG Tao，XIAN Lei，et al.Department of Cardiothoracic Surgery，First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 530021，China

    ［Abstract］  Objective  By analyzing the relationship between the atrial fibrillation patients of mitral stenosis of rheumatic heart disease and HCN4 gene in muscles of right atrium，constructing the theorical basis of development of atrial fibrillation ocurring in mitral stenosis of rheumatic heart disease.Methods  Semi-quantitative reverse transcription-PCR(RT-PCR） was used to detect and quantify the mRNAs of HCN4 gene in the atria of two groups with atrial fibrillation(thirty eight patients） or without atrial fibrillation(fourteen patients），then we analysised the sequence of PCR products of HCN4 gene，evaluated of HCN4 gene mRNA with the ratio of starting quantity of HCN4 gene and house-keeping gene β-actin.Results  HCN4 genes homology was 100 percent with the BLAST process in genebank of NCBI.The relative expression value （±s） in experimental group and control group was repective 0.696±0.257 and 0.125±0.010，mRNA  of  HCN4 gene in ataria increased significantly compared with   control group (P<0.01）.Conclusion  The overexpression of HCN4 gene might participate in the progress of atrial fibrillation development in mitral stenosis of rheumatic heart disease，which reveals the molecular mechanism of one function of HCN4 gene.

    ［Key words］  HCN4 gene；mitral stenosis of rheumatic heart disease；atrial fibrillation；sequence analysis

    HCN4基因属于超级化激活环核苷酸门控阳离子通道基因家族（HCN），参与编码超极化激活阳离子电流（If）通道结构蛋白，是心脏动作电位的缓慢的舒张期自动去极化激活的一个重要组成部分，参与窦房结细胞自发性舒张期膜去极化过程，具有调控起搏的功能。心房颤动（atrial fibrillation，Af）为风湿性心脏病二尖瓣狭窄最常见和严重的并发症之一，合并房颤患者的病死率是无房颤患者的2倍。目前对风心二狭心房纤颤发病机制的研究已进入分子水平。HCN4基因突变可能与病态窦房结综合征（sick sinus syndrome，SSS），Af等多种心律失常相关。1999 年 Ludwing等［1］在筛查cDNA文库时，通过探针发现HCN4基因的cDNA。随后，Seifert等［2］从人类丘脑cDNA文库中使用PCR技术和重组体质粒构建成功克隆出HCN4基因。2003年，Stieber等［3］又通过原位杂交和免疫组织化学分析，发现HCN4基因在发育中的胚胎心脏上高表达。

    本研究中测定风心二狭房颤患者HCN4基因部分序列，并根据此序列采用RT－PCR法从mRNA水平分析HCN4基因在风心房颤二狭患者表达改变，为风心二狭房颤发生机制奠定理论基础。

    1  材料与方法

    1.1  临床标本  病例来源于我院2007年3月～2008年3月进行二尖瓣置换术的风湿性二尖瓣狭窄患者52例，以是否并发心房颤动分为试验组和对照组。试验组患者38例，男18例，女20例，年龄26～68岁，平均（48±11）岁。对照组患者14例，男6例，女8例，年龄21～62岁，平均（44±13）岁。全部标本均为术中获取右心耳心肌标本约100 mg，取材后速冻于液氮中，-80 ℃超低温贮存备用。

    1.2  主要的试剂和仪器  RNAsimple Total RNA Kit(总RNA提取试剂盒，TIANGEN公司，北京），RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit(逆转录试剂盒，Fermentas公司，美国），TaKaRa Ex TaqTM(TaKaRa公司，大连），dNTP Mixture(TaKaRa公司，大连），柱式PCR产物纯化试剂盒(QIAGEN公司，德国），Thermo PXE0.2 PCR扩增仪(Thermo公司，美国），3730XL DNA分析系统(ABI公司，美国），紫外分光光度计（UVC-515，美国），水平凝胶电泳槽（BIO-RAD公司，美国），凝胶数字成像仪（BIO-RAD公司，美国）。

    1.3  引物的设计及合成  参考GenBank中人HCN4基因(NM_005477）和β-actin(NM_001101）基因的核苷酸序列，在保守区域分别设计特异性引物，HCN4基因扩增片段长度为233 bp；β-actin扩增片段长度为186 bp。引物由大连宝生物公司合成，两个基因的引物序列分别如下：HCN4基因:上游引物:5’-CCCGCCTCATTCGATATATTCAC-3’，下游引物:5’-GAGCGCGTAGGAGTACTGCTTC-3’；β-actin:上游引物:5’-TGGCACCCAGCACAATGAA-3’，下游引物:5’-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3’。

    1.4  RNA提取及RT－PCR半定量分析目的基因  按总RNA提取试剂盒（RNAsimple Total RNA Kit）说明书提取总RNA，溶于DEPC处理的去离子水中，-70 ℃保存备用。应用紫外分光光度计检测，A280/A260≥1.8为合格。所提取的总RNA经1.5%，琼脂糖凝胶电泳鉴定，证明其完整性。取总RNA 3μg进行逆转录反应，步骤按逆转录试剂盒（Fermentas公司，美国）操作说明书进行，逆转录的cDNA置-20 ℃保存。逆转录反应体系及条件：RNA 3 μg，oligo(dT）18 primer(0.5 μg/μl）1 μl，加DEPC处理的去离子水至12 μl，振荡混匀3～5 s，70 ℃ 5 min；加入5×reaction buffer 4 μl，RiboLockTM Ribonuclease inhibitor(20 u/μl） 1 μl，10 mM dNTP mix 2 μl，轻微振荡、离心，37 ℃ 5 min；加入 RevertAidTM M-MuLV Reverse Transcriptase(200 u/μl）1 μl至总体积20 μl，42 ℃ 60 min，70 ℃ 10 min，置入冰中。50 μl PCR体系中含DNA模板2 μl，TaKaRa Ex Taq 0.25 μl，dNTP Mixture 4 μl，10×Ex Taq Buffer 5 μl，Forward Primer和Reverse Primer分别为1 μl(20 mM）和1 μl(20 mM），加DEPC水36.75 μl至50 μl。反应条件为:94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，扩增40个循环。扩增产物用2.0％琼脂糖凝胶电泳，紫外分光光度计检测结果并摄像，凝胶电泳图像应用Biosens image analysis system分析电泳条带灰度值，mRNA表达的相对强度＝目的基因条带灰度值／β－action条带灰度值，以两者比值作为目标基因的相对表达含量。

    1.5  HCN4基因PCR产物测序  PCR产物经2%的琼脂糖凝胶电泳，采用QIAGEN公司的QIAquick Gel Extraction Kit试剂盒按说明进行胶回收纯化，PCR产物测序按常规方法［4］进行。

    1.6  统计学处理  应用SPSS16.0(USA）软件进行统计学分析，各组计量资料以均数±标准差（±s）表示。组间数据比较采用独立样本t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

    2  结果

    2.1  提取的组织总RNA质量和纯度  按总RNA提取试剂盒法提取风心二狭房颤患者右心房组织总RNA，经紫外分光分析仪检测A260/A280（±s）为1.895±0.086，提示总RNA质量较好。

    2.2  HCN4基因在心房肌组织中的表达  试验组和对照组中HCN4基因mRNA表达分别是0.696±0.257和0.125±0.010（表1）。试验组患者心房肌组织中HCN4基因明显高于对照组心房肌组织(P<0.01），提示风心二狭房颤患者心房肌组织中HCN4基因表达上调（图1～3）。表1  两组心房肌组织HCN4基因表达水平的比较

    2.3  HCN4基因标准品测序结果  分别进行两次PCR扩增，经胶回收的PCR产物送至上海生物公司进行测序，得到同样的结果（图4），测序序列通过BLAST程序送至NCBI基因库进行同源性检索，HCN4序列同源性为100%(图5）。

    3  讨论

    心脏频率调节是由动作电位的缓慢的舒张期自动去极化阶段引起。超极化激活阳离子电流（If）是去极化激活的一个重要组成部分，是混合的Na+-k+内流的心脏膜电流。If被超级化激活的环核苷酸调控通道基因家族（HCN）所编码，具有调控起搏的功能。HCN家族包括HCN1、HCN2、HCN3、HCN4四种亚型。HCN4基因位于人染色体15q23-q24，全长5065 bp，含有8个外显子，分子量为129.1 kDa［5］。HCN4基因的编码产物HCN4蛋白是由1203个氨基酸组成，包含6个跨膜片段(S1-S6），一个孔道区以及一个环核苷酸结合域（CNBD）。其中S4片段有一群带正电荷的氨基酸，具有电压感受器作用，类似于在去极化激活的电压门控K+通道中的作用。HCN4通道的激活元件包括S1，S1-S2的联结子，S2及S6的C末端区域［6，7］。位于 S5 和 S6 间的一段氨基酸序列部分贯穿细胞膜内，是形成亲水性孔道而使离子选择性通过的部分，称为孔道区(pore region） 或 P区，有大多数K+选择性通道所特有的 GYG标志序列。不过除GYG标志之外的氨基酸序列和 K+选择性通道是不一样的，是造成对 K+选择性低的原因。HCN通道还表现出与环腺苷酸门控通道的高度同源性，即在 C末端存在一个120个氨基酸的 CNBD，它的作用是调节通道对cAMP反应［8］。将 CNBD 切除后可模拟 cAMP效应，即 HCN 门控的电压依赖性被移向更正的电压水平，其幅度类似于cAMP饱和浓度时的最大效应。

    Robinson 等［9］研究指出，心力衰竭患者的心室肌上有If的明显变化。这个观察结果支持一种假设If在心力衰竭、心肌肥厚和心房颤动等这些获得性心律失常存在时的过度表达导致心律失常的发生。故HCN4基因在获得性心律失常的发生中可能是一个关键性的起搏通道基因，且其致病机制为HCN4基因表达上调和If的增大。

    我们的研究结果显示风心二狭房颤患者心房肌组织中HCN4基因mRNA的表达率高于对照组患者心房肌组织（P＜0.01）。结果证实了风心二狭房颤患者心房肌组织中确实存在HCN4基因的过度转录表达，提示HCN4基因的过度转录表达可能参与了调控风心二狭房颤的发生过程。HCN4基因表达增高导致风心二狭房颤发生的机制可能是：超极化激活阳离子电流（If）增大，激发心房肌自发性舒张期膜去极化过程，从而提高心房肌自律性［10］。功能基因mRNA表达水平的变化，可进一步影响到发挥生物学功能的蛋白质表达量的改变，最终导致不同的生理及病理过程。因此，在各种生理及病理状态下对基因表达水平进行研究，将为进一步了解基因的功能、疾病发生、发展提供有用的信息。本研究中发现HCN4mRNA表达量与风心二狭房颤发生密切相关，与Robinson等的观点基本一致，揭示了HCN4基因作用的分子机制，将为风心二狭房颤的诊断和新的治疗方法提供理论基础。

【参考文献】
  1 Ludwig A，Zong X，Stieber J，et al.Two pacemaker channels from human heart with profoundly different activation kinetics.EMBO J，1999，18(9):2323-2329.

2 Seifert R，Scholten A，Gauss R，et al.Molecular characterization of a slowly gating human hyperpolarization-activated channel predominantly expressed in thalamus，heart，and testis.Proc Natl Acad Sci USA，1999，96（16）:9391-9396.

3 Stieber J，Herrmann S，Feil S，et al.The hyperpolarization-activated channel HCN4 is required for the generation of pacemaker action potentials in the embryonic heart.Proc Natl Acad Sci USA，2003，100（25）:15235-15240.

4 萨姆布鲁克· J，拉塞尔·DW.黄培堂（译）.分子克隆实验指南，第3版.北京：科学出版社，1996，627-628.

5 Hofmann F，Biel M，Kuapp UB.International Union of Pharmacology.LI.Nomenclature and structure-function relationships of cyclic nucleotide-regulated channels.Pharmacol Rev，2005，57(4):455-462.

6 Ishii TM，Takano M，Ohmori H，et al.Determinants of activation kinetics in mammalian hyperpolarization-activated cation channels.J Gen Physiol，2001，53（1）： 93-100.

7 Wang J，Chen S，Siegelbaum SA.Regulation of hyperpolarization-activated HCN channel gating and cAMP modulation due to interactions of COOH terminus and core transmembrane regions.J Gen Physiol，2001，118（3）：237-250.

8 Gauss R，Seifert R，Kaupp UB，et al.Molecular identification of a hyperpolarization-activated channel in sea urchin sperm.Nature，1998，393（6685）:583-587.

9 Robinson RB，Siegelbaum SA.Hyperpolarization-activated cation currents:from molecules to physiological function.Annu Rev Physiol，2003，65:453-480.

10 Michels G，Er F，Khan I，et al.Single-channel properties support a potential contribution of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels and if to cardiac arrhythmias.Circulation，2005，111（4）:399-404.

作者单位：530021 广西南宁，广西医科大学第一附属医院心胸外科（△通讯作者）