大承气汤对急性出血坏死性胰腺炎急性肺损伤大鼠肺泡巨噬细胞的影响

【摘要】  目的 观察大承气汤对急性出血坏死性胰腺炎（AHNP）并发急性肺损伤（ALI）大鼠肺泡巨噬细胞的影响。方法 SD大鼠经胆胰管逆行注射5%牛磺胆酸钠（1 ml/kg，0.1 ml/min）诱发AHNP，AHNP+DT组在造模后30 min用大承气汤（10 ml/kg）灌胃；AHNP+DEX组在造模后30 min经尾静脉地塞米松（0.5 mg/100 g）注射；AHNP+DT+DEX组则于造模后30 min同时给予大承气汤（10 ml/kg）灌胃和地塞米松（0.5 mg/100 g）尾静脉注射，比较3、6、12、24 h各个时间段不同治疗方法支气管灌洗液肺泡巨噬细胞数量、吞噬功能和肺干湿比变化。结果 AHNP+DT组和AHNP+DT+DEX组两组肺泡巨噬细胞的数量明显减少、吞噬功能减弱，与模型组和AHNP+DEX组比较，P< 0.05，差异有显著性。结论 大承气汤能抑制肺泡巨噬细胞的吞噬活性、改善急性肺损伤。

【关键词】  大承气汤；急性出血坏死性胰腺炎；急性肺损伤；肺泡巨噬细胞；吞噬功能

Effects of Chinese medicine Dachengqi decoction on function of pulmonary alveolar macrophages of rat’s acute lung injury induced by acute hemorrhagic necrotizing pancreatitis

    CHEN Jie,PAN Zhi-jian.Department of Surgery,The Third People’s Hospital of Zaoyang,Zaoyang 441200,China

    ［Abstract］  Objective  To study the effect of Chinese medicine Dachengqi decoction（DT） on pulmonary alveolar macrophage（PAMs） of rat’s acute lung injury（ALI）induced by acute hemorrhagic necrotizing pancreatitis（AHNP）.Methods  AHNP model was induced by intraductul administration of 5% sodium taurocholate in SD rat.The group of DT was given Dacheng qi decoction by oral administration in 30 minutes after model established（10 ml/kg），the group of DEX was given DEX by vena caudalis injection in 30 minutes after model established（0.5 mg/100 g）.The group of  DT +DEX was given medicine by oral administration and vena caudalis injection in 30 minutes after model established.Animals were killed on various hours after model established（3,6,12,24 h）.We observed the change of bronchoalveolar lavage，the function of PAMs，the number of PAMs and the lung relative weight in different period.Results  Compared with the model group and the DEX group，the number and the phagocytic function of PAMs reduce significantly in DT group and DT +DEX group（P<0.05）.Conclusion  DT could reduced significantly the phagocytic function of PAMs and AHNP-ALI.

    ［Key words］  Dachengqi decoction；acute hemorrhagic necrotizing pancreatitis；acute lung injury（ALI）；pulmonary alveolar macrophages（PAMs）；phagocytic function

    大承气汤为临床经验方制剂，主要由柴胡、大黄、芒硝、枳实等组成，具有通里攻下、清热解毒、活血化瘀之功效，对急性出血坏死性胰腺炎（AHNP）具有显著疗效。本研究利用大鼠急性出血坏死性胰腺炎（AHNP）急性肺损伤（ALI）模型，探讨了胰必清对AHNP并发ALI大鼠肺泡巨噬细胞吞噬功能的影响，为临床治疗AHNP并发ALI提供理论依据。

    1  材料与方法

    1.1  动物及分组  健康雄性SD大鼠120只，体重（220±20）g，由华中科技大学实验动物中心提供。随机分为A组（假手术对照组，n=24只），B组（AHNP组，n=24只），C组（AHNP+DT组，n=24只），D组（AHNP+DEX组，n=24只），E组（AHNP+DT+DEX组，n=24只）。每组再根据宰杀时间分为3、6、12、24 h小组，每小组6只（n=6）。

    1.2  药物  大承气汤由本院药剂科制备。配方主要由大黄20 g,枳实15 g，芒硝15 g，柴胡15 g，黄芩15 g，厚朴15 g，鱼腥草30 g，蒲公英30 g，木香10 g，茵陈15 g等10余种中草药组成，煎制出提取液200 ml，每毫升煎剂约含生药1 g，冷却后放入冰箱冷藏备用。

    1.3  主要仪器与试剂  低温自动平衡离心机（美国Beckman Coulter公司）；微机型分光光度仪（美国Beckman Coulter公司）；CO2培养箱（美国Forma Scientific）；超净工作台（北京半导体设备厂）。RPMI1640培养基（美国HyClione-pierce公司），淀粉酶（AMY）试剂盒（南京建成生物技术研究所），鲎试剂定量检测试剂盒（上海伊华临床医学科技公司），牛磺胆酸钠（美国Sigma公司）。

    1.4  动物模型制作  手术采用3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉（40 mg/kg），无菌条件下，腹壁正中切口入腹，显露出十二指肠，找到胆胰管十二指肠乳头开口，在十二指肠乳头对侧肠壁用4号小注射器针头在浆膜层刺一小孔，用PE50导管在浆膜下经乳头部逆行插入胆胰管0.5 cm，用小动脉夹固定，同时在胰胆管出肝门处用小动脉夹夹闭防止注射药物逆流入肝，以5%牛磺胆酸钠匀速注入（1 ml/kg，0.1 ml/min），注毕后拔管，5 min后去除小动脉夹，缝合腹壁。

    1.5  实验动物处理  A组（假手术对照组）：大鼠开腹后仅轻微翻动胰腺、十二指肠后关腹，不给予任何治疗措施。B组（AHNP组）：造模后不做任何处理；C组（AHNP +DT组）：造模后30 min大鼠麻醉清醒用大承气汤10 ml/kg灌胃。D组（AHNP +DEX组）：制备模型成功后30 min经尾静脉注入地塞米松注射液（0.5 mg/100 g）。E组（AHNP +DT+DEX组）：造模型成功后30  min，经尾静脉注入地塞米松注射液（0.5 mg/100 g），待大鼠麻醉清醒再用大承气汤10 ml/kg灌胃。各组内24 h宰杀小组大鼠在术后12 h再给予相同治疗一次。所有大鼠实验前禁食12 h，不禁水。术后均不禁食水，背部注射生理盐水4 ml补液。于术后3、6、12、24 h每组分别取相应大鼠，下腔静脉采血待行生化检查，腹主动脉放血处死，开胸取肺，左肺离体行支气管肺泡灌洗，右肺上叶行病理检查，右肺下叶留待行肺干湿比测定。

    1.6  大鼠肺泡巨噬细胞的获取

    1.6.1  支气管肺泡灌洗（BAL）  参照文献［1］进行。

    1.6.2  细胞存活率测定  取支气管肺泡灌洗液（BALF）细胞悬液10 μl与0.1%台盼蓝溶液以1∶1的比例混合，立即用细胞计数板镜下计数，细胞存活率在95%以上，方可进行细胞计数和吞噬功能测定。

    1.7  观察指标及方法

    1.7.1  肺组织病理学检查  10%中性甲醛固定，石蜡包埋切片，HE染色固定，Olimpus显微镜观察。

    1.7.2  右肺下叶干湿比测定  动物放血致死后取右肺下叶称湿质量，置60 ℃烤箱连续烘烤24 h，去除水分，称肺干质量，计算肺湿/干比值。

    1.7.3  血清内毒素  采用鲎试剂偶氮基质显色法定量检测。

    1.7.4  淀粉酶水平  采用碘比色法，结果以u/L苏氏单位表示。

    1.7.5  支气管灌洗液（BALF）  肺泡巨噬细胞计数：BALF以1 800 r/min离心10 min，再以RPMI-1640培养液冲散细胞块、洗涤细胞2次，弃去上清液。沉淀部分以含10%小牛血清的RPMI-1640培养液调匀细胞后，取少量细胞悬液加入等体积的1%冰醋酸，进行细胞计数。

    1.7.6  肺泡巨噬细胞吞噬功能的测定  将各组收集的肺泡巨噬细胞浓度调至1×106/ml，分别加入24孔板内，置37 ℃ 5% CO2条件下贴壁2 h，取出弃上清，漂洗，再加入0.1%中性红每孔加入生理盐水液1 ml，置37 ℃ 5% CO2条件下培养20 min，取出，弃上清，漂洗，加入1 ml细胞溶解液（乙醇：乙酸=1∶1），充分溶解后于540 nm波长处比色，反映肺泡巨噬细胞活性。

    1.8  统计分析  采用SPSS 13.0软件进行分析。

    2  结果

    2.1  肺组织病理学改变  大体观察，A组大鼠肺外观色泽粉红，无明显异常。B组3、6、12、24 h肺组织体积增大，重量增加，呈暗红色，包膜下可见出血灶，切面有血性液体渗出；C、D、E组造模后3、6、12、24 h体积稍增大，外观呈粉红色，包膜下无出血，切面无明显血性渗液渗出。光镜下观察，A组可见肺组织结构清楚，肺泡内无白细胞浸润和红细胞。B组3、6、12、24 h肺组织病变以广泛肺泡出血、肺间隔增厚、肺间质淤血、大量炎性细胞浸润为主，C、D、E组造模后肺组织病变以肺间质水肿及间质充血为主，炎性细胞浸润显著减轻。

    2.2  肺干湿比、血清淀粉酶水平的变化  大承气汤对AHNP并发ALI大鼠右肺下叶干湿重比值、血清淀粉酶的影响见表1。本实验条件下，与B组比较，C、D、E组3、6、12、24 h右肺下叶干湿重比值、血清淀粉酶水平显著下降（P<0.05，差异有统计学意义）。与C、D组比较，E组3、6、12、24 h右肺下叶干湿重比值、血清淀粉酶下降更显著（P<0.05，差异有统计学意义）。表1  大承气汤对AHNP并发ALI大鼠肺干湿重比、血清淀粉酶的影响注：与A组比较，▲P<0.05，差异有统计学意义；与B组比较，△P<0.05，差异有统计学意义；与C、D组比较，▼P<0.05，差异有统计学意义

    2.3  大承气汤对AHNP并发ALI大鼠血清内毒素、BALF中肺泡巨噬细胞（PAMs）浓度、吞噬功能的影响（表2）   本实验条件下，与B组比较，C、E组3、6、12、24 h血清内毒素水平、BALF中肺泡巨噬细胞浓度、吞噬功能显著下降（P<0.05，差异有统计学意义）。与B组比较，D组单纯应用地塞米松后3、6、12、24 h BALF中肺泡巨噬细胞浓度无明显下降（P>0.05，差异无统计学意义）。表2  大承气汤对AHNP并发ALI大鼠血清内毒素、BALF中PAMs浓度、吞噬功能的影响注：与A组比较，▲P<0.05，差异有统计学意义；与B组比较，△P<0.05，差异有统计学意义；与B组比较，▼P>0.05，差异无统计学意义

    3  讨论

　　AHNP患者并发胰外器官损伤中以ALI/ARDS最为突出，约占AHNP的20%，占AHNP患者发病第一周内所有死亡人数的60%［2，3］，成为AHNP的主要死亡原因。目前，AHNP并发ALI的发病机制尚未完全清楚，阐明它的发生机制有助于改善AHNP的预后，降低死亡率。目前认为肺泡巨噬细胞是启动AHNP后ALI的元凶，而肺泡巨噬细胞的活化是多因素的结果。AHNP的早期由于胰腺的血液微循环障碍、肠道细菌易位，以及血浆灭活内毒素能力的下降，导致血清内毒素水平和机体对内毒素敏感性水平的升高，引发肺泡巨噬细胞的活化，过度激活中性粒细胞，释放大量损害性炎性介质包括细胞因子，再通过这些炎性介质网络，引起连锁和放大效应，即所谓的级联效应，形成恶性循环导致ALI。AHNP引起的ALI机制涉及白细胞活化、炎性介质网络学说和信号传导通路的变化［4］。糖皮质激素常用于治疗各种原因所致的ALI/ARDS［5］。Meduri等［6］在发病早期应用小剂量糖皮质激素治疗，显著改善了患者的肺功能和机械通气时间。李洪霞等［7］亦发现应用地塞米松有利于重建炎症介质/抗炎介质平衡，减轻大鼠ALI。但糖皮质激素的应用有其自身的缺点，最近美国国立心肺心液研究所临床试验网络研究认为：不推荐在ALI/ARDS中常规应用糖皮质激素治疗，并且在ARDS中晚期开始应用糖皮质激素治疗会增加病死率［8］。中药大承气汤是通过其多途径多靶点作用而发挥治疗作用的，在AHNP并发ALI中的肺脏保护作用可以通过调节肺泡巨噬细胞的活性来实现。对肺泡巨噬细胞的活性调节可能通过以下途径实现：（1）清热解毒作用：减少内毒素的产生；（2）通里攻下作用：减少肠道细菌易位、减少内毒素吸收入血。（3）活血化瘀作用：减少PLA2的产生，抑制胰酶的产生。研究显示大承气汤具有活血化瘀的作用，使血液的黏稠度下降，红细胞的聚集性降低，从而使微循环障碍得到改善。在AHNP大鼠的治疗中，能降低弹性蛋白酶的活性，减少血小板活化因子的释放，对脏器的损害有保护作用。可改善AHNP微循环，减少氧自由基的损伤，对AHNP时胰酶的释放有显著的抑制作用，可促进胃肠运动和肠内容物的排出，保护肠黏膜屏障，从而减少肠道细菌移位。能明显改善AHNP大鼠的生存状态，降低死亡率。本实验研究中，大鼠DT组与AHNP模型组比较，血清内毒素水平、淀粉酶水平、肺干湿重比、肺泡巨噬细胞数量和吞噬功能差异有统计学意义（P<0.05），说明大承气汤能通过调节内毒素的吸收，调节肺泡巨噬细胞活性，达到治疗AHNP并发ALI的目的。通过DEX组与DT组比较可知地塞米松对内毒素水平、肺泡巨噬细胞数量和吞噬功能没有明显影响，说明中药大承气汤在治疗AHNP并发ALI方面较地塞米松有更多的优势。而DEX+DT组对血清淀粉酶水平和肺干湿比的影响较DT组和DEX组有明显改善，显示了中药大承气汤联合地塞米松在治疗AHNP并发ALI方面有协同作用。肺泡巨噬细胞的作用在AHNP并发ALI中正越来越受到重视，对其深入实验研究将会为临床早期预防和治疗打开一条新的思路。

【参考文献】
  1 孙秀泓，罗自强.肺的非呼吸功能基础与临床.北京:人民卫生出版社，2003，328-329.

2 Frossard JL，Hadengue A，Spahr L，et al.Pastor CM.Natural history of long-term lung injury in mouse experimental pancreatitis.Crit Care Med，2002，30: 1541-1546.

3 Bhatia M.Novel therapeutic targets for acute pancreatitis and associated multiple organ dysfunction syndrome.Curr Drug Targets Inflamm Allergy，2002，1: 343-351.

4 Shields CJ，B Ch A，Winter DC，et al.Lung injury in acute pancreatitis: mechanisms，prevention，and therapy .Current Opinion in critical care，2002，8（2）:158-163.

5 周明根，黄子通.急性呼吸窘迫综合征药物治疗进展.中国呼吸与危重监护杂志，2004，3:267-270.

6 Meduri GU，Golden E，Freire AX，et al.Methylprednisolone infusion in patients with early acute respiratory distress syndrome significantly（ARDS） improves lung function results of a randomized controlled trial（RCT）.Chest，2005，128（Suppl 4）:129.

7 李洪霞，张进川，赵亚力.地塞米松对急性肺损伤大鼠炎症介质/抗炎介质表达的影响.中国呼吸与危重监护杂志，2003，1:65-68.

8 The National Heart lung and Blood Institute Acute Respiratory Distress Syndrome（ARDS）Clinical Trials Network.Efficacy and safety of corticosteroids for persistent acute respiratory distress syndrome.N Eng J Med，2006，354（16）:1671-1684.

作者单位：1 441200 湖北枣阳，枣阳市第三人民医院外科 2 430050 湖北武汉，武汉市第五医院外科（通讯作者）