金克对胃癌细胞的抑制作用

【摘要】  目的 拟探讨金克是否能诱导胃癌肿瘤细胞凋亡，金克能否有效用于胃癌患者的治疗。方法 利用MTT法和Sub-G1法分析金克诱导抑制细胞的能力。将不同浓度的金克与胃癌细胞孵育，在不同的时间点收获，探求金克诱导胃癌细胞抑制的最佳作用时间及作用浓度。结果 通过MTT法和Sub-G1法分析结果显示金克对胃癌细胞的抑制作用，浓度为1.5 g/L的金克诱导胃癌细胞36 h后抑制率达到高峰。结论 MTT法和Sub-G1法是两种快捷、有效检测药物作用的方法，金克对于胃癌细胞的抑制作用介于低度敏感和不敏感之间，但其能增强免疫，无明显毒副作用，具有极大的临床应用前景。

【关键词】  金克；胃癌细胞；抑制作用；Sub-G1；MTT法

Inhibitation  of gastric cancer cells induced by Jinke

    CHENG Jie，PAN Zhi-jian.Department of Surgery，The Third People’s Hospital of Zaoyang，Zaoyang 441200，China

    ［Abstract］  Objective  To study the ability of Jinke to induce the gastric cancer cells（MKN-28） apoptosis，and whethere Jinke may be used in gastric cancer patients’chemotherapy.Methods  The ability of Jinke to inhibit cells was detected by the MTT method，the inhibitation ratio reached its top apex，then we detected the apoptosis rate induced by Jinke with the Sub-G1 method.Results  When MKN-28 cells were induced by 1.5 g/L Jinke，for 36 h，with the MTT method，the inhibitation ratio reached its top apex，apoptosis rate deteceted by Sub-G1 method reached to the top apex.Conclusion  Jinke could induce gastric cancer cells apoptosis，though the chemotherapy sensltivity is not high，without side effect，Jinke may enhance patients’ immune ability and increase living ratio of late phase cancer patients，so its clinical use is very important.

    ［Key words］  Jinke;gastric cancer cell;inhitation;Sub-G1;MTT method

    槐耳清膏作为一种重要的抗癌中药，目前已有其成品（金克槐耳颗粒，国家一类新药）运用于临床，对肝癌、肺癌、食管癌、胃癌等均有独特疗效。已有实验表明槐耳清膏能诱导人肺腺癌细胞Ａ549凋亡。但其诱导细胞凋亡的机制仍不清楚。本实验拟探讨金克是否能诱导胃癌肿瘤细胞凋亡，通过MTT法，Sub - G1分析金克诱导抑制细胞的能力，以阐明其在胃癌化疗中的药用价值。

    1  材料与方法

    1.1  药物与试剂  金克（槐耳清膏）由江苏盖天力药业有限公司提供，碘化丙啶（PI），核糖核酸酶（RNase A），FITC标记的膜联蛋白（FITC-Annexin-V），PRMI-1640培养基，以上均为Sigma公司产品，MTT（晶美生物），小牛血清（Gibco公司），0.25%胰酶，0.04 mol/L酸化异丙醇。

    1.2  细胞  胃癌细胞株MKN-28购自武汉大学。

    1.3  仪器和器材  FAC-Sort流式细胞仪（美国B.D公司），台式高速离心机，恒温水浴箱，低温冰箱，高压灭菌锅，磁力振荡器，微量加样器，恒温CO2培养箱，超净工作台，高温烤箱，超低温冰箱，超滤除菌器（美国Gelman公司），移液器10 μl、5~40μl、50~200 μl、1 000 μl各一个，96孔、24孔培养板若干，酶联免疫测定仪（BIO-RAD），孔板离心机（SIGMA-4K15），倒置显微镜。

    1.4  实验方法

    1.4.1  药品制备  精确称取槐耳清膏1 000 mg（由江苏盖天力药业有限公司提供），将其溶解于10 ml PRMI-1640培养基，以0.22 μm超滤除菌器（美国Gelman公司）过滤除菌，制备成10 mg/ml的PRMI-1640浓缩含药培养液，实验时稀释成不同浓度备用。

    1.4.2  细胞培养和处理  （1）  细胞培养：胃癌细胞株MKN-28用常规方法培养：胃癌细胞株MKN-28购自武汉大学。培养条件：加1%青霉素、1%链霉素、10%小牛血清的PRMI-1640培养液，相对湿度94%，5% CO2，37 ℃，细胞浓度为2×105/ml传代。（2） 细胞处理：胃癌细胞株用常规方法培养，取对数生长期细胞进行实验。将细胞分为对照组、不同浓度金克（0.75 g/L，1.5 g/L，3.0 g/L）诱导组，共同培养12 h后，每6  h收集细胞，然后将每组细胞分3份，分别用于MTT法、Sub-G1法检测。

    1.4.3  MTT法检测金克对胃癌MKN-28的抑制作用  将对数生长期胃癌细胞用0.25%胰酶消化，用灭菌PBS稀释离心去上清，用培养基重悬细胞计数，调整细胞浓度为106/ml，将细胞按每孔90 μl种板，将细胞分为对照组、不同浓度金克（0.75 g/L，1.5 g/L，3.0 g/L）诱导组，每孔设两复孔，按6 h，12 h，18 h，24 h，30 h，36 h，42 h，48 h设计分别种板，分别在6 h，12 h，18 h，24 h，30 h，36 h，42 h，48 h收获，用孔板离心机离心去上清，0.25%胰酶消化，每孔加90 μl培养基重悬细胞，每孔加MTT 10 μl，并增设阴性对照，37 ℃孵育4 h，每孔加入0.04 mol/L酸化异丙醇100 μl，用吸管反复吹打使接近结晶颗粒溶解后，用免疫酶标仪在570 nm波长测光密度值（OD值）。

    1.4.4  Sub-G1法检测金克诱导胃癌MKN-28细胞的凋亡  将对数生长期细胞分为对照组、不同浓度（0.75 g/L，1.5 g/L，3.0 g/ L） 金克诱导组，共同培养18 h 后，每6 h 收集细胞，然后将每组细胞分两份，分别用Sub-G1 法检测。将收获新鲜细胞用PBS 洗涤一次，80 %的冰乙醇固定过夜，PBS 洗涤一次，加100 μl 浓度为10 mg/L的PI和5 0 μl 浓度为0.1%的RNase A，室温下避光放置20 min，用流式细胞术检测。经上述处理的细胞，荧光标记成功后，应用FAC Sort流式细胞仪检测。经488 nm激光激发，被标记细胞发射的红色（PI）被FAC Sort流式细胞仪的标准透镜接受。应用Cellquest软件（B．D．公司，美国），对上述所测细胞的单参数荧光强度、任一细胞群体的平均荧光强度进行分析。

    1.4.5  结果的判断  MTT法取三个复孔光密度值（OD）的平均值作为细胞在此药组的平均光密度值（OD）。按公式计算肿瘤细胞的抑制率：

    抑制率=对照组OD值-用药组OD值   对照组OD值-空白组OD值×100%

   被（PI）标记细胞经488 nm激光激发发射的红色荧光被FAC Sort流式细胞仪的标准透镜接受。应用Cellquest软件（B．D．公司，美国），对上述所测细胞的单参数荧光强度、任一细胞群体的平均荧光强度进行分析。

    2  结果

    2.1  金克对MKN-28细胞抑制率的影响  见表1。表1  金克对MKN-28细胞抑制率的影响

    2.2  Sub-G1检测1.5 g/L金克诱导MKN-28细胞凋亡率  见图1。对照 4.2%，24 h 19.76%，36 h 33.46%，48 h 29.38%。

 　 从结果中可以看出MTT法检测1.5 g/L金克作用36 h达到最佳抑制率32.56%，同时，在该药物浓度，时间Sub-G1法检测金克诱导MKN-28细胞凋亡率33.46%，均高于30%。金克对诱导MKN-28细胞的凋亡作用介于低度和中度敏感［1］。

    3  讨论

　　四唑盐快速比色法（MTT法）是一种检测细胞存活和生长的方法。1983年Mossman根据细胞能量代谢水平与DNA合成水平相平行的原理，建立了四唑盐比色法［2］。由于活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶能脱下琥珀酸氢原子，使其氧化成延胡索酸。而MTT作为脱下氢原子的接受剂被还原成蓝紫色的甲簪，反应产物甲簪颜色与活细胞成正比。凡具有代谢活性的细胞无论处于静止期还是分裂图1  Sub-G1检测1.5 g/L金克诱导MKN-28细胞凋亡率 期，都有还原MTT的作用，而死细胞和红细胞则没有这种能力［3，4］。利用此原理测定抗肿瘤药物作用于肿瘤细胞的变化并计算出药物对肿瘤细胞的抑制率。自MTT法应用于抗肿瘤药物敏感性实验以来，其以简单、快速、敏感性好等优点而被临床和科研广泛应用。但作为一种新的方法仍存在一些问题，如：（1） 三个平行孔之间的吸光度值的标准差平均值为0.08，对肿瘤细胞抑制率越高则吸光度值越低，同样误差情况下，结果产生的差异相对越大，所获结果就会高于实际敏感性结果［5］。（2）某些有色药物易影响酶标仪的检测结果造成假阴性。（3）反应产物甲簪的溶解剂的不稳定性也会影响结果的精确度。（4）研究人员发现丝裂霉素作用3天后的死细胞中仍保留了活细胞24%的琥珀酸脱氢酶活性，使甲簪产量偏高［6］，这也会影响MTT法的灵敏度。本实验中使用的药物金克为有色药物，在实验过程中使用孔板离心机去上清的方法除去有色液体，重悬细胞，排除药物颜色对实验结果的干扰而使实验结果更为精确。细胞凋亡（apoptosis，Ap）是不同于坏死（necrosis） 的一种自主的程序性自杀性死亡（programmed cell death，PCD）。在细胞凋亡晚期，细胞内核酸内切酶激活，并在核小体间切割DNA 链，使DNA 降解为以核小体（ 200 bp） 为单位的片段。细胞被固定后，小分子DNA 片段由胞内渗出，细胞内DNA 含量明显降低，在G1期峰前以Sub-G1峰的形式出现而被识别［7~9］。由此原理建立的Sub-G1法因其操作简便快捷且费用低而得到广泛应用。但对于早期凋亡细胞而言，断裂的DNA 片段较少或片段较大，DNA 因而渗出较少，故应用Sub-G1法无法检测到早期凋亡细胞，且其不能准确地分析细胞凋亡的周期时相性。因此，Sub-G1法的应用具有一定的局限性。Nakazato等将根治性切除胃癌病例（n=262例），术后随机分为单纯化疗组（MMC+5-FU）和免疫化疗组（MMC+5-FU+槐耳颗粒）进行试验，所有病例随诊5年以上，发现免疫化疗组的5年无病生存率70.7%，而单纯化疗组仅为59.4%，两组之间差异有显著性（P<0.01）［10，11］。总之，MTT法和Sub-G1法是两种快捷、有效检测药物作用的方法，同时金克能直接诱导肿瘤细胞凋亡，提高机体的免疫力，对机体无毒副作用，对中晚期肿瘤患者能明显改善存活率。金克对于胃癌细胞的抑制作用介于低度敏感和不敏感之间，但是能增强免疫，无明显毒副作用，具有极大的临床应用前景。

【参考文献】
  1 辛华雯，王润帮，杜光祖.MTT法在恶性肿瘤体外药物敏感试验中的临床应用.实用癌症杂志，1994，9（2）：73-75.

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4 Turtinen LW，Juran BD.Standardization and comparisonor an XTT based TNF arpnabioassay with a TNF-arpha ELISA.Biotechniques，1998，24:232-234，236-238.

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7 Gong JP，Traganos F，Darzynkiewicz Z.A selective procedurefor DNA extraction from apoptotic cells applicable for gelelectrophoresis and flow cytometry.Anal Biochem，1994，218:314-319.

8 Gorczyca W，Gong J，Darynkiewicz Z，et al.Detection of DNA strand breaks in individual apoptotic cells by the in situterminal deoxynucleotidyl translation assays.Cancer Res，1993，52:1945-1951.

9 Elstein KH，Thomas DJ，Zucker RM.Factors affecting flowcytometric detection of apoptotic nuclei by DNA analysis.Cytometry，1995，21:170.

10 Nakazato H，Koike A，Saji S，et al.Efficacy of immunochemotherapy as adjuvant treament after curative resection of gastric cancer.Lancet，1994，343:1122-1126.

11 刘星野，周默巍，徐枫，等.金克槐耳颗粒配合FAM治疗晚期胃癌38例.浙江肿瘤，1995，5 （3）：189.

（本文编辑：乔 雨）

作者单位：1 441200 湖北，枣阳市第三人民医院外科 2 430050 湖北，武汉市第五医院外科（通讯作者）