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【摘要】 目的 探讨基质金属蛋白酶-7（MMP-7）和金属蛋白酶组织抑制因子-1（TIMP-1）在膀胱移行细胞癌中的表达及意义。方法 应用免疫组织化学技术检测60例膀胱移行细胞癌［Ⅰ级25例，Ⅱ级15例，Ⅲ级20例；浅表性膀胱癌（Tis～T1）29例，浸润性（T2～T4）31例］和5例正常膀胱组织中MMP-7和TIMP-1的表达情况，χ2检验分析其表达与膀胱移行细胞癌分级分期的关系。结果 MMP-7和TIMP-1在正常膀胱组织中不表达，而在膀胱移行细胞癌组织表达较强。60例膀胱移行细胞癌标本中MMP-7阳性表达40例（66.7%）。MMP-7的阳性表达率与肿瘤的病理分级显著相关，而与肿瘤的临床分期无明显相关性。60例膀胱移行细胞癌标本中TIMP-1阳性表达32例（53.3%）。TIMP-1在不同的组织分化程度，不同临床分期之间均差异无统计学意义（P＞0.05）。而MMP-7/TIMP-1表达比值与肿瘤的病理分级显著相关。结论 MMP-7及MMP-7/TIMP-1比值可反映膀胱移行细胞癌的恶性程度，为膀胱移行细胞癌的预后判断提供一种新的参考指标。
【关键词】 膀胱肿瘤；癌；金属蛋白酶类； 金属蛋白酶组织抑制因子
Expression and significance of matrix metalloproteinase-7 and tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1 in transitional cell carcinoma of bladder
LI Wen-lin，DUAN Jian-min，MA Guang-xu,et al.Traditional Chinese Medicine Hospital of Rizhao，Rizhao 276800，China
［Abstract］ Objective To evaluate the expression of matrix metalloproteinase-7（ MMP-7）and tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1（TIMP-1）in transitional cell carcinoma of bladder（TCCB）and its significance.Methods Immunohistochemistry was used to detect the expression of MMP-7 and TIMP-1 in 60 cases of BTCC（Grade Ⅰin 25 cases，Grade Ⅱ in 15，Grade Ⅲ in 20）and 5 subjects with normal bladder tissues.Of the 60 cases 29 had superficial（≤pT1）bladder cancer and 31 had invasive（≥pT2）bladder cancer.χ2 test was used to assess the relationship between expression of MMP-7，TIMP-1 and tumor grade，stage.Results The expression of MMP-7 and TIMP-1 were negative in all normal bladder tissues but high in BTCC.Of the 60 cases，40 were positive and 20 were negative for MMP-7.MMP-7 positivity was correlated with high histogical grade，but no significant difference was observed between superficial bladder cancer and invasive bladder cancer.32 were positive and 28 were negative for TIMP-1.TIMP-1 was no significant difference in different pathological grades or different clinical stages.But the ratio of MMP-7/TIMP-1 was correlated with high histogical grade.Conclusion MMP-7 and the ratio of MMP-7/TIMP-1 could reflect more accurately the malignant degree of BTCC.These results would provide a new significant marker in estimate of prognosis in patients with BTCC.
［Key words］ bladder neoplasmas;carcinoma;matrix metalloproteinases;tissue inhibitor of matrix metalloproteinases
基质金属蛋白酶是人体内降解细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的主要酶类，在肿瘤演进等众多生理和病理过程中均发挥重要的作用［1］。MMP-7是MMPs家族中的主要成员之一，与多种肿瘤的恶性生物学表现以及预后密切相关。金属蛋白酶组织抑制因子（TIMPs）通过下调MMPs的活性及分泌，而抑制肿瘤的浸润和转移［2］。我们采用免疫组化方法检测60例膀胱移行细胞癌组织标本中MMP-7和TIMP-1的表达，探讨 MMP-7 、TIMP-1表达在膀胱移行细胞癌发生发展中的意义。
1 材料与方法
1.1 组织标本 2005年至2008年外科手术切除且经病理诊断的膀胱移行细胞癌组织标本60例。男52例，女8例。年龄41～78岁。病理分级按WHO标准，Ⅰ级25例，Ⅱ级15例，Ⅲ级20例。临床分期按UICC-TNM标准，浅表性癌（Tis～T1）29例，浸润性癌（T2～T4）31例。5例正常膀胱组织作为对照。组织均经福尔马林固定，常规石蜡包埋。
1.2 实验试剂 一抗分别为鼠抗人MMP-7单克隆抗体，稀释度1∶75；鼠抗人TIMP-1单克隆抗体，稀释度为1∶100，二抗生物素标记兔抗鼠IgG及S-P试剂盒均购于北京中杉金桥生物技术公司。
1.3 免疫组织化学检测 采用免疫组化S-P法。石蜡标本作4 μm厚连续切片，切片常规脱蜡，梯度酒精水化，抗原修复；3％过氧化氢孵育，加入一抗于4 ℃中孵育过夜。滴加生物素标记二抗及S-P复合物。DAB显色，苏木素复染，无水酒精脱水，二甲苯透明，中型树胶封片，光镜观察。用已知胃癌阳性切片作阳性对照，用PBS代替一抗作阴性对照。HE染色进行分级分期。
1.4 结果判定 镜下观察，以肿瘤细胞、间质细胞中出现棕黄色颗粒判定为阳性细胞，高倍镜下随机观察三个不同视野并计数200个细胞，按阳性细胞率和显色强度分为三级，阳性细胞率＜25％或无显色为阴性（－），阳性细胞率25％～50％或显色浅为阳性（＋），阳性细胞率＞50%或显色深为强阳性（＋＋）。
1.5 统计学方法 计量资料比较采用单因素方差分析，计数资料比较采用χ2检验，小样本资料使用Fisher精确检验法。所有资料均输入计算机，用SPSS 11.5统计软件完成。
2 结果
2.1 MMP-7和TIMP-1在膀胱移行细胞癌及正常膀胱组织中的表达情况 膀胱移行细胞癌组织中MMP-7的蛋白质表达只定位于癌细胞浆内，呈均匀棕黄色颗粒，集中分布于肿瘤浸润先端即肿瘤与间质交界处，癌组织表层及中央部均呈现弱表达，间质及正常上皮细胞为阴性表达。60例膀胱移行细胞癌组织中40例MMP-7阳性表达，阳性率为66.7％。对照组5例正常膀胱组织标本全部呈阴性表达。TIMP-1主要位于癌细胞胞膜、胞浆和肿瘤组织间质内。胞浆呈不同程度、基本均匀的棕色反应，呈巢状或片状分布于肿瘤病灶的周边区、间质及血管临界面，肿瘤组织内部癌细胞表达较少。60例膀胱移行细胞癌组织中32例TIMP-1阳性表达，阳性率为53.3％。对照组5例正常膀胱组织标本全部呈阴性表达。
2.2 MMP-7、TIMP-1表达及MMP-7/TIMP-1比值与肿瘤分级分期的关系 MMP-7、TIMP-1蛋白表达与肿瘤分级、分期的关系见表1。 表1 MMP-7、TIMP-1表达与BTCC的分级、分期之间的关系
经统计分析，膀胱移行细胞癌Ⅱ级和Ⅲ级的MMP-7阳性表达率差异无统计学意义（P＝0.631），但Ⅰ级与Ⅱ级以及Ⅰ级与Ⅲ级之间的差异具有统计学意义（P＝0.014，P=0.001）。MMP-7在侵犯到肌层的浸润性癌（T2～T4）中的阳性表达率与浅表性癌比较有升高的趋势，但无统计学意义（P=0.465）。TIMP-1的阳性表达随肿瘤的分级分期增加呈递增趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）。将MMP-7、TIMP-1（－）、（＋）、（＋＋）表达分别记作1、2、3分，将半定量资料转化成定量资料，采用单因素方差分析发现，MMP-7/TIMP-1比值与肿瘤病理分级密切相关，随着分级增加呈递增趋势（P＜0.05）。MMP-7/TIMP-1比值在侵犯到肌层的浸润性癌与浅表性癌比较有升高的趋势，但无统计学意义（P＞0.05）。
3 讨论
在肿瘤浸润和转移过程中，肿瘤细胞离开原发病灶，浸润肌层、周围组织和血管等过程均需要突破细胞外基质和基底膜屏障，MMP家族在此过程中发挥了重要作用［3］。MMP-7又称基质溶解素，是MMP家族中最小的独立分子，也是一个比较重要的成员。本试验结果显示，MMP-7在膀胱移行细胞癌组织中的表达明显增高，在正常膀胱组织中无表达，表明其可能在肿瘤的发生过程中起一定作用。 MMP-7主要集中在肿瘤浸润先端的癌细胞中高表达，说明了这些癌细胞可通过分泌MMP-7来降解周围细胞外基质，使自己更易于局部游走，侵入邻近毛细淋巴管及小静脉，促成局部浸润和远膈转移。本实验结果还显示，MMP-7的表达与膀胱移行细胞癌的细胞分化程度有密切关系，随着癌细胞分级的增高，MMP-7的表达亦增强，提示分化越差的肿瘤表达MMP-7的能力越强，即肿瘤细胞产生蛋白降解酶的能力越强，利于肿瘤细胞降解细胞外基质和基底膜，发生浸润和转移。另外，MMP-7的表达与浸润深度无显著相关性，浅表癌和浸润癌表达水平上的差异无统计学意义，在Ta、T1期已有明显表达，提示MMP-7在细胞发生恶性转化以后，在膀胱移行细胞癌的发生早期就参与癌的进展，如果阻断MMP-7的活性，可能阻止膀胱移行细胞癌发生浸润和转移［4］。
在正常情况下，MMPs的活性受到多种因素影响并在不同水平调节，包括基因转录、酶的合成分泌、酶原激活及抑制物的相互作用。以酶原形式分泌出来的MMPs主要受TIMPs的抑制，TIMPs调控是MMPs活性的主要调节因子。本试验结果显示，TIMP-1在正常膀胱组织中无表达，在膀胱移行细胞癌组织中有53.3%表达，较MMP-7表达减弱，提示其对肿瘤细胞浸润、转移过程的抑制作用降低，这种降低的作用包括TIMP-1量和功能的异常。TIMP-1的阳性表达与膀胱移行细胞癌的分级分期无显著相关，但MMP-7/TIMP-1比值与肿瘤病理分级密切相关，这可能与MMPs的调控有关。国内外学者对于TIMPs在抑制肿瘤浸润与转移中的作用进行研究，认为MMPs与TIMPs之间的平衡与细胞外基质降解的关系可能更为密切［5］。膀胱移行细胞癌中TIMP-1的高表达可能是对MMP-7过表达的一种反应性增高。也就是说，随着膀胱移行细胞癌分级增高，MMP-7表达显著增高，而TIMP-1也表达增高，但其增高程度小于MMP-7。这种MMP-7：TIMP-1不平衡，使瘤细胞侵袭能力显著增强，导致恶性行为的发生。MMPs与TIMPs 在肿瘤浸润和转移过程中的相互作用，也为抗肿瘤转移治疗提供了一个重要靶点。McCabe等［6］研究发现二十二碳六烯酸（一种多烯不饱和脂肪酸，鱼油中含量较高）可通过提高TIMP-1表达抑制肾癌细胞的浸润。目前某些具有MMPs抑制作用的药物已进入了Ⅲ期临床研究阶段［7］。
实验结果提示，MMP-7在细胞外基质和基膜降解中起重要作用，MMP-7及MMP-7/TIMP-1比率可反映膀胱移行细胞癌的恶性程度，为膀胱移行细胞癌的预后判断提供一种新的参考指标。对MMP-7及TIMP-1的研究开发可能为膀胱移行细胞癌的治疗提供一个新的途径。
【参考文献】
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6 McCabe AJ，Wallace JM，Gilmore WS，et al.Docosahexaenoic acid reduces in vitro invasion of renal cell carcinoma by elevated levels of tissue inhibitor of metallo- proteinase-1.J Nutr Biochem，2005，16:17-22.
7 Purcell WT，Rudek MA，Hidalgo M，et al.Development of matrix metallo- proteinase inhibitors in cancer therapy.Hematol Oncol Clin North Am，2002，16:1189-1227.
（本文编辑：江 宇）
作者单位：1 276800 山东，日照市中医医院泌尿外科 2 730030 甘肃，兰州大学第二医院泌尿外科