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【摘要】 目的 研究环氧化酶-2抑制剂塞来昔布(Celecoxib)和化疗药物卡培他滨(Capecitabine)对裸鼠人肝癌模型中肿瘤细胞增殖与凋亡的影响。方法 建立LIC-D35裸鼠人肝癌模型，成瘤后40只裸鼠随机分成4组即对照组、塞来昔布组、卡培他滨组、联合用药组(卡培他滨与塞来昔布)。观察肿瘤大小，计算抑瘤率;采用RT-PCR方法观察肿瘤中COX-2的mRNA表达，并应用免疫组化法Ki-67检测肿瘤细胞增殖水平、末端脱氧核苷转移酶标记法(TUNEL)检测凋亡细胞。结果 对照组、塞来昔布组、卡培他滨组、联合组瘤体体积分别为(3 880±438)mm3、(3 374±465)mm3、(1 859±362)mm3和(981±197)mm3;塞来昔布组、卡培他滨组、联合用药组抑瘤率分别为15%、45%和71%。四组中Ki-67阳性率分别为46%、32%、25%和11%;肿瘤细胞凋亡指数DI分别为8%、22%、27%和38%;塞来昔布组、联合组肿瘤组织中COX-2 mRNA表达显著低于对照组和卡培他滨组(P<0.01)。结论 塞来昔布可显著抑制裸鼠人肝癌模型中肿瘤细胞COX-2 mRNA表达，抑制肿瘤细胞Ki-67表达，诱导肿瘤细胞凋亡。与卡培他滨联合应用可提高抗肿瘤效果。
【关键词】 环氧化酶-2抑制剂;裸鼠;肝肿瘤
Effect of celecoxib combined with capecitabine on tumor growth of hepatocellular carcinoma in nude mice
HUANG Xin-yu，WANG Hong-cheng，PAN Ye，et al.Department of Surgery，Shanghai Sixth People’s Hospital，Shanghai Jiaotong University，Shanghai 200233，China
Objective To evaluate the effect of celecoxib combined with capecitabine on proliferation and apoptosis of hepatocellular carcinoma in nude mice.Methods LIC-D35 liver tumors were orthotopically implanted in 40 nude mice and divided randomly into 4 groups:the control group(A)，the celecoxib group(B)，the capecitabine group(C)and the celecoxib combined with capecitabine group(D).Results Tumor volume was(3 880±438)mm3，(3 374±465)mm3，(1 859±362)mm3，(981±197)mm3 in the control，celecoxib，capecitabine and combined group，respectively.The rate of tumor inhibition was 15% in the celecoxib group，45% in the capecitabine group and 71% in the combined group.Immunohistochemical assays for tumor proliferation(Ki-67)showed the tumor cell proliferation Ki-67 positive rate was 46%,32%,25%，11% respectively and apoptosis index(TUNEL)was 8%，22%，27%，38%，respectively.The expression of COX-2 mRNA by RT-PCR method in celecoxib group and combined group showed it was highly suppressed compared with the control group and capecitabine group.Conclusion Celecoxib can suppress the expression of COX-2 mRNA of tumors orthotopic implanted in nude mice，it reduce proliferation and induce apoptosis of tumor cell;By combine with capecitabine，it can improve its anti-tumor activities.
[Key words] COX-2 inhibitor;nude mice;hepatocellular carcinoma
研究表明，环氧化酶-2抑制剂可抑制肿瘤增殖，诱导肿瘤细胞凋亡[1]。近来研究发现环氧化酶抑制剂可增强肿瘤放射和化疗敏感性[2，3]。但也有不同报道。文献中环氧化酶-2抑制剂在肝癌中的研究报道很少，其抗癌作用机制尚不清楚。本实验采用人肝癌裸鼠模型(LIC-D35)，对塞来昔布联合卡培他滨在人肝癌裸鼠模型中肿瘤抑制作用进行研究，并探讨其作用机制。
1 材料与方法
1.1 构建人肝癌裸鼠模型 BALB/c裸小鼠(中科院上海实验动物中心提供)，40只均为雄性，SPF级，4 ～6周龄，体质量约18～20 g。取人肝癌裸鼠转移模型LIC-D35 瘤源(复旦大学肝癌研究所瘤源)按照规范原位接种于裸鼠肝左叶内。成瘤率达100%。随机分成4组：对照组(生理盐水)、塞来昔布组、卡培他滨组、联合组，每组各10只。
1.2 相关药物及试剂 塞来昔布购自美国辉瑞公司，卡培他滨为瑞士罗氏公司产品，Ki-67试剂盒、TUNEL试剂盒均为DAKO公司产品。Tripure总RNA提取试剂盒、M-MLV逆转录酶、Taq酶、RNA酶抑制剂(均购自美国Promega公司);COX-2引物(上海生物工程公司合成)，上游引物:5′-CAGCACTTCACGCATCAGTT-3′，下游引物:5′-TCTGGTCAATGGAAGCCTGT-3′，产物片段长342 bp。
1.3 实验方法 肿瘤种植术后5天开始治疗。对照组蒸馏水灌胃，每只0.3 ml/d，连续3周;塞来昔布组用Celecoxib灌胃，每只25 mg/(kg·d)，连续3周;卡培他滨组用Capecitabine 1.8 mmol/(kg·d)，连续3周灌胃、联合组Celecoxib和Capecitabine，用药剂量及给药途径与单独用药组相同。实验第42天用颈椎脱臼法处死所有模型鼠。用游标卡尺测量肿瘤长、短径，计算肿瘤体积(V)，V=长径×短径2/2。肿瘤抑制率=(对照组体积-实验组体积)/空白对照组体积×100%。将标本一半放置液氮中保存，一半置于中性福尔马林中固定。
1.4 免疫组织化学染色 肿瘤组织经10%甲醛固定后，石蜡包埋，4 μm厚连续切片。用免疫组化法Ki-67检测肿瘤细胞增殖水平、Ki-67 阳性为细胞核染为棕黄或棕褐色，每例切片观察5 个高倍视野，每个视野计100 个细胞中阳性细胞所占百分比。细胞凋亡检测采用末端脱氧核苷转移酶标记法(TUNEL)，按TUNEL试剂盒说明书进行，以细胞核呈棕黄色颗粒状为阳性凋亡细胞，在光镜下(×400)随机选取5个视野对凋亡细胞进行计数，并以AI表示凋亡细胞的多少，即100个完整细胞中平均凋亡细胞数的百分数表示。
1.5 RT-PCR 检测COX-2 mRNA表达。(1)总RNA的提取：按Tripure试剂说明书进行。琼脂糖变性凝胶电泳检测RNA的完整性，紫外分光光度计测定260 nm/280 nm的吸收峰值以确定RNA的含量和纯度，将RNA调整至1 μg/μl。(2)cDNA合成:依次加入MgCl2(25 mmol/L)2 μl、dNTPs(各10 mmol/L)1 μl，RNAsin(40 U/ml)0.25 μl、反转录酶XL(5 U/m 0.5μl 0)、随机引物0.5 μl，37 ℃温浴1 h，合成cDNA。(3)PCR反应:以同一cDNA为模板，在30 μl反应体系内扩增COX-2。循环条件：95 ℃预变性5 min后，95 ℃ 50 s，55 ℃1 min，72 ℃ 1 min，循环35次。最后72 ℃延伸7 min。取5 μl PCR产物于1.8%琼脂糖凝胶电泳(80 V，30 min)，内对照3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)，凝胶成像仪分析RT-PCR产物带的积分吸光度值。
1.6 统计学处理 运用SPSS 11.5 统计分析软件进行数据处理，组织标本COX-2 mRNA相对表达值呈非正态分布，比较用秩和检验，免疫组化结果比较用χ2检验。检验标准α=0.05。
2 结果
2.1 药物对肿瘤生长的影响 见表1。治疗结束后，对照组、塞来昔布组、卡培他滨组、联合用药组移植瘤体积分别为：(3 880±438)mm3、(3 374±465)mm3、(1 859±362)mm3和(981±197)mm3，塞来昔布和卡培他滨组抑瘤率分别为15%和 45%，两者联用抑瘤率明显增加，达71%。与对照组比较，塞来昔布组、卡培他滨组和联合用药组肿瘤生长明显缓慢(P<0.05)。联合用药组抑瘤率较塞来昔布和卡培他滨单用抑瘤率明显提高(P<0.05)。
2.2 肿瘤组织中Ki-67及TUNEL检测 见表2，图1、2。对照组、塞来昔布组、卡培他滨组、联合组的Ki-67 阳性表达率分别为46%、32%、25%和11%，四组中肿瘤细胞凋亡指数DI分别为8%、22%、27%和38%;表明塞来昔布、卡培他滨能明显抑制肿瘤细胞增殖;并且均能诱导肿瘤细胞凋亡，二者联合运用后其作用进一步加强，各组差异有统计学意义(P<0.05)。表1 药物对人肝癌裸鼠模型中肿瘤生长的影响表2 肿瘤组织中Ki-67及TUNEL检测组别 Ki-67(%) TUNEL(%)
2.3 COX-2 mRNA的表达 采用RT-PCR方法观察肿瘤中COX-2的mRNA表达，结果发现对照组、卡培他滨组、COX-2 mRNA明显表达，塞来昔布组、联合组表达明显抑制(图3)。经秩和检验，差异有显著统计学意义(P<0.01)。表明塞来昔布能明显裸鼠人肝癌模型中肿瘤细胞COX-2 mRNA表达。
3 讨论
肝癌是临床预后较差的肿瘤之一，易发生肝内、外转移，手术切除率低、术后复发率高。因此，寻找有效的抗肝癌药物，可改善肝癌患者的预后。环氧化酶是体内前列腺素合成过程中的重要限速酶，它有COX-1和COX-2二种亚型，前者是结构型酶，在大多数组织细胞中持续低浓度表达，参与维持机体正常的生理功能。COX-2是一种可诱导型酶，其基因定位于染色体1q 25.2～25.3，约8.3 kb，含10个外显子和9个内含子，编码604个氨基酸的开放阅读框架。研究表明，COX-2在许多恶性肿瘤中高度表达。由于COX-2参与多种肿瘤的发生、发展和转移，因此，选择行COX-2抑制剂在肿瘤防治中的作用已逐渐成为人们关注的热点。Wang等[1]报道，Celecoxib 通过诱导肿瘤细胞凋亡而抑制人结肠癌模型中肿瘤生长。De Heer等[4]报道Celecoxib能抑制裸鼠结肠肿瘤肝转移。近来有流行病学资料显示COX-2抑制剂对肿瘤发生具有肯定的预防作用，在中、高度结直肠癌风险和低心血管疾病风险人群中使用Celecoxib可能是最佳选择[5]。COX-2抑制剂除对肿瘤本身有一定抑制作用外，它还可以增加化疗药物抗肿瘤活性。Irie等[2]动物实验发现Celecoxib可以明显加强5-FU抗癌作用。Watkins等[6]临床研究发现:Gemcitabine，Irinotecon联合Celecoxib治疗胆管癌6例，1例完全缓解，1例部分缓解，2例病情稳定，且患者全部耐受良好，显示了一定疗效。卡培他滨是新一代口服5-FU前体药物，在肿瘤体内转化为5-FU，从而使其针对性更强，不良反应更低。它作为单药或与其他药物联合运用在直肠癌、乳腺癌等已显示出满意疗效，近来报道在肝癌中有一定作用。我们采用LIC-D35裸鼠人肝癌模型，观察塞来昔布、卡培他滨以及二者联合应用对肿瘤生长的影响。结果发现塞来昔布和卡培他滨组抑瘤率分别为 34.60%和 46.70%，两者联用抑瘤率明显增加，达 66.09%，与对照组比较，塞来昔布组、卡培他滨组和联合用药组肿瘤生长明显缓慢(P<0.05);联合用药组抑瘤率较塞来昔布和卡培他滨单用抑瘤率明显提高(P<0.05)。有关COX-2抑制剂抑制肿瘤的确切作用机制尚不清楚，可能涉及环氧化酶介导和非环氧化酶介导二条途径。包括下调前列腺素，阻止肿瘤血管形成，下调基质金属蛋白酶等，但更为重要的是诱导肿瘤细胞凋亡。我们采用免疫组化方法检测肿瘤细胞增殖水平(Ki-67)，结果发现，塞来昔布组Ki-67阳性率为32%，显著低于对照组46%(P<0.05)。提示塞来昔布可以抑制肿瘤细胞增生。采用末端脱氧核苷转移酶标记法(TUNEL)检测凋亡细胞，发现塞来昔布组肿瘤细胞凋亡指数为22%，显著高于对照组7.8%，与化疗药物卡培他滨联合后凋亡指数达38%(P<0.01)。我们采用RT-PCR方法测定四组肿瘤组织中COX-2的mRNA表达，发现对照组、卡培他滨组COX-2 mRNA明显增高，塞来昔布组、联合组表达明显抑制，提示塞来昔布对裸鼠人肝癌肿瘤的抑制作用主要是通过COX-2 mRNA表达引起。塞来昔布与卡培他滨联合应用可提高抗肿瘤效果。综上所述，塞来昔布可明显抑制裸鼠人肝癌肿瘤的生长，其抑制作用主要是通过COX-2 mRNA表达引起，通过抑制肿瘤细胞Ki-67表达，诱导肿瘤细胞凋亡。与卡培他滨联合应用可提高抗肿瘤效果。但其最佳药物浓度、应用时间、不良反应等还有待于进一步研究。(本文图片见封三)
【参考文献】
1 Wang L，Chen W，Xie X，et al.Celecoxib inhibits tumor growth and angiogenesis in an orthotopic implantation tumor model of human colon cancer.Exp Oncol，2008，30(1):42-51.
2 Irie T，Tsujii M，Tsuji S，et al.Synergistic antitumor effects of celecoxib with 5-fluorouracil depend on IFN-γ.Int J Cancer，2007，121(4):878-883.
3 Zh Liao，Komaki R，Milas L，et al.A phase i clinical trial of thoracic radiotherapy and concurrent celecoxib for patients with unfavorable performance status inoperable/unresectable non-small cell lung cancer clin.Cancer Res，2005，11:3342-3348.
4 De Heer P，Sandel MH，Guertens G，et al.Celecoxib inhibits growth of tumors in a syngeneic rat liver metastases model for colorectal cancer.Cancer Chemother Pharmacol，2008，62(5):811-819.
5 Arber N.Cyclooxygenase-2 inhibitors in colorectal cancer prevention:point.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2008，17(8):1852-1857.
6 Watkins JF，Mayo MS，Smith HJ，et al.Gemcitabine，irinotecan and celecoxib in patients with biliary cancer.Anticancer Drugs，2009，20(4)：294-300.