TGF-β1基因转染BMSCs后复合软骨细胞共培养

【摘要】  目的 探讨应用TGF-β1基因转染和软骨细胞共培养后，促进大鼠BMSCs目的基因向软骨细胞的分化效果，为构建新型的软骨种子细胞提供思路。方法 6周龄健康雄性Wistar大鼠、扩增、提取质粒pcDNA 3.1-TGF-β1，酶切、电泳鉴定并测序。实验分组：TGF-β1基因转染BMSCs组(A组)、单纯BMSCs与软骨细胞共培养组(B组)、TGF-β1转染BMSCs后复合软骨细胞共培养组(C组)、空白BMSCs对照组(D组)、软骨细胞对照组(E组)。结果 电泳显示TGF-β1目的基因条带，基因测序与Gene-Bank cDNA序列相符。MTT法测定A、B、C、D、E组细胞在490 nm波长处的吸光度值，C组与A、B、D、E组间差异有统计学意义(P<0.01)。RT-PCR和Western blot检测目的基因和蛋白的表达量、TGF-β1表达均以C组最多，A组次之;Ⅱ型胶原表达以C组最多，A组次之。结论 通过TGF-β1转染同时复合软骨细胞共培养能有效促进BMSCs向软骨细胞分化，是一个较有前景的发展方向，对组织工程软骨应用于临床具有重要意义。

【关键词】  BMSCs;共培养;软骨细胞;TGF-β1

Co-culture of BMSCs transfected by TGF-β1 and chondrocytes

　　ZHAN Xing-wang，LI Jian-xin，WEI Jian，et al.Department of Bone，the Affiliated Hospital of Medical College of Chinese People’s Armed Police Force，Tianjin 300162，China

　　 Objective To investigate the secretion of target gene and differentiation of BMSCs transfected by TGF-β1 and co-culture and together into chondrocytes and to provide a new method for culturing seed cells in cartilage tissue engineering.Methods The plasmids pcDNA 3.1-TGF-β1 were amplified and extracted，then cut by enzymes，electrophoresed and analyzed its sequence.BMSCs of Wistar rats were separated and purificated by the density gradient centrifugation and adherent separation.The morphologic changes of primary and passaged cells were observed by inverted phase contrast microscope and cell surface markers were detected by immunofluorescence method.According to the transfect situation，the BMSCs were divided into 5 groups，the transfected group(Group A)，the co-culture group(Group B)，the group of TGF-β1 and co-culture(Group C)，the group of BMSCs(Group D)，the group of chondrocytes(Group E).After being transfected，the cells were selected，then the proliferation activity was tested by MTT and expression levels were tested by RT-PCR and Western blot.Results The Group C showed that it had a good prospect and important significance of clinic application in cartilage tissue engineering.TGF-β1 gene bands，gene sequencing were consistent with Gene-Bank cDNA sequences.The absorbance value with MTT determination of A，B，C，D，E group of cells in 490 nm wavelength in C group was statistically different with A，B，D，E groups(P<0.01).RT-PCR and Western blot detection were done for gene and protein expression，TGF-β1 expression in group C were most，A group followed by;Ⅱ collagen expression in C group was most，A group followed by.Conclusion By TGF-β1 transfecting cells and culturing chondrocytes at the same time is effective in promoting differentiation of BMSCs to chondrocytes.It has more great significance in clinical application of tissue-engineered cartilage.

　　[Key words] bone marrow stromal stem cells;co-culture;chondrocytes;TGF-β1

　　关节软骨损伤是临床常见病、多发病，但软骨组织的自我修复能力有限，现有的治疗方法存在许多不足。组织工程学技术为软骨损伤的治疗提供了广阔前景，常用BMSCs作为软骨组织工程种子细胞：(1)在适当的培养条件和某些外源性和内源性生物活性因子刺激下具有向软骨细胞分化的能力[1，2];(2)体外增殖能力强，表型稳定，来源方便;(3)自体移植可避免免疫排斥。许多研究表明TGF-β1具有诱导BMSCs向软骨细胞分化的能力[3~4]。国内外许多研究也表明BMSCs和软骨细胞共培养，能够发挥协同效应，诱导BMSCs向软骨细胞分化[5]。外源性应用生长因子效率低，持续时间短，因此我们的研究在脂质体介导下，将TGF-β1基因转染后复合软骨细胞共培养，使BMSCs向软骨细胞转化，以期获得更大的软骨诱导效应和促增殖效应，为治疗软骨损伤和退变的组织工程软骨提供新思路。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物与主要试剂及仪器 6周龄健康雄性Wistar大鼠2只，体重约150 g，由武警医学院动物实验中心提供。质粒pcDNA 3.1-TGF-β1由金斯瑞生物科技公司构建;L-DMEM培养(Gibco公司);FBS(Hyclone公司，美国);胰蛋白酶(Sigma公司);Trizol Reagent、LipofectamineTM2000(Invitrogen公司，美国);Percoll分离液(Pharmacia公司);TGF-β1、Ⅱ型胶原小鼠抗大鼠单克隆抗体、ALP标记羊抗小鼠二抗(Neomaker公司);质粒DNA小量、中量提取试剂盒(Promega公司)。倒置相差显微镜、荧光显微镜(Olympus公司);超低温离心机(Sigma公司);PowerPac2000电泳仪、Mini-Protein Ⅲ垂直板电泳装置(BIO-RAD公司);PCR仪(Biometra公司);凝胶成像系统(天能公司)。

　　1.2 质粒pcDNA3.1-TGF-β1扩增、提取与鉴定 取1 μg TGF-β1质粒转化大肠杆菌感受态细胞，挑单克隆、质粒DNA小量提取试剂盒小提质粒、酶切、电泳鉴定并测序。质粒DNA中量提取试剂盒大量提取质粒，于-20 ℃保存备用。

　　1.3 BMSCs的分离培养 将Wistar大鼠颈椎脱臼法处死，无菌操作下取其四肢的长骨，用注射器抽取长骨内骨髓，加含10%胎牛血清的DMEM培养基吹打制成单细胞悬液，分装于2个25 cm培养瓶中，取少量细胞计数。在37 ℃、5% CO2及饱和湿度条件下静止培养5天。第6天首次细胞换液，以后每2～3天换液1次。待第10～14天贴壁细胞长满瓶底部后用0.25%胰蛋白酶和0.01% EDTA的混合溶液消化并传代培养细胞。

　　1.4 软骨细胞的分离与培养 将Wistar大鼠颈椎脱臼法处死，在无菌操作下从其四肢的关节中取软骨，将软骨切成1～3 mm大小置无菌试管，PBS冲洗3次，1 000 r/min离心3 min，吸去PBS，加0.25%胰酶4 ml，置5% CO2培养箱30 min，吸出胰酶后再加入0.2% Ⅱ型胶原酶5 ml，置恒温摇床箱内消化6～8 h。观察大部分软骨块被消化后，收集消化液，800 r/min离心5 min，用培养液洗2次。细胞计数后移入25 cm培养瓶中，使细胞密度为2×104/L，加DMEM培养液(含10%胎牛血清，100 u/ml青-链霉素)，置37 ℃、5% CO2培养箱中培养，每2天换液1次。原代细胞贴壁并融合成单层后传代培养。

　　1.5 聚羟基乙酸(PGA)支架的处理 取非编织的线性PGA 5 mg，均匀放入预制的圆柱状(内径5 mm、高1 mm)模具中，加入100 μl乙醇，压制成直径5 mm，厚度1 mm的圆柱体(PGA直径13～15 μm，制作后所得支架孔隙率约90%)。充分晾干后放入培养皿中，75%乙醇浸泡1 h，紫外线照射30 min。PBS洗涤3次，每次10 min，吸干后备用。

　　1.6 实验分组 实验共分4组，转染组(A组)：加入TGF-β1基因转染后BMSC;与软骨细胞共培养组(B组)：取浓度为3×106/L的第二代BMSCs和软骨细胞，按2∶1比例混匀共培养作为种子细胞;TGF-β1基因转染复合软骨细胞共培养组(C组);空白对照组(D组)：加入单纯BMSCs;软骨细胞对照组(E组)。

　　1.7 检测指标

　　1.7.1 MTT法检测转染基因对BMSCs增殖活性的影响 各组细胞以每孔1×104/ml接种于96孔板中，各10孔，每孔加培养液200 μL，24 h后每孔加入MTT 20 μL，37 ℃孵育4 h，弃孔内培养上清液，每孔加入150 μL DMSO，振荡10 min，选择490 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度值。

　　1.7.2 RT-PCR检测TGF-β1和Ⅱ型胶原表达 根据GeneBank TGF-β1、Ⅱ型胶原cDNA序列，利用Primier 5.0引物设计软件设计引物，GAPDH根据文献[6]，委托上海英俊生物技术有限公司合成。TGF-β1：上游引物5′-GCCTTTCCTGCTTCTCA-3′，下游引物5′-GCCTTTCCTGCTTCTCA-3′，280 bp;Ⅱ型胶原：上游引物5′-TGGTGGAGCAGCAAGAG-3′，下游引物5′-ATGGGTGCGATGTCAATA-3′，398 bp;GAPDH：上游引物5′-TGGAAATCCCATCACCATCT-3′，下游引物5′-GTTCATGCCCATCACAAACA-3′，198 bp。RNA提取按Trizol说明书进行，抽提细胞总RNA。取1 μg RNA进行逆转录，得到第1股cDNA，产物用于扩增目的基因。TGF-β1的PCR条件为：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，72 ℃ 10 min;30个循环。Ⅱ型胶原的PCR 条件为：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，72 ℃ 10 min;35个循环。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。采用ScnImage软件测定条带的净灰度值(net index，NI)，并与内参照GAPDH灰度值进行比较，计算其比值。每组8个样本。

　　1.7.3 Western blot检测TGF-β1和Ⅱ型胶原蛋白表达 PBS漂洗各组BMSCs，加入冰预冷的裂解液后，收集细胞裂解物于EP管中。超声波粉碎细胞，4 ℃下，离心半径15 cm，12 000 r/min离心10 min;收集上清液，取5 μl测定蛋白浓度。以每泳道10 μl(3 μg/μl)加入SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳槽中进行电泳;电泳完毕后转移至醋酸纤维素薄膜;室温下脱脂奶粉封闭3 h后加入TGF-β1、Ⅱ型胶原(1∶200)一抗单克隆抗体，4 ℃过夜，TBST洗膜3次;室温下二抗(1∶200)孵育2 h，TBST洗膜3次，ALP显色，SDS-8000成像系统拍照。β-actin为内参，采用ScnImage图像分析软件测定灰度值。每组8个样本。

　　1.7.4 细胞形态学观察及细胞材料的黏附情况 倒置相差显微镜下连续观察细胞在支架材料上的黏附及细胞外基质的分泌情况。

　　1.8 统计学分析 数据应用SPSS 11.5软件包进行统计学分析，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 质粒鉴定 TGF-β1质粒基因测序与GeneBankcDNA序列相符。EcoRⅠ和XhoI双酶切pcDNA-3.1-IGF-1经琼脂糖电泳分析可切下约408 bp的IGF-1cDNA和5 426 bp pcDNA 3.1(+)序列;EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切pcDNA 3.1-TGF-β1经琼脂糖电泳分析可切下约1 176 bp的TGF-β1 cDNA和5 468 bppcDNA 3.1(+)序列。

　　2.2 BMSCs形态学观察 原代细胞接种24 h后，培养瓶底可见少量贴壁且伸出突起的细胞。4、5天后数量逐渐增多，细胞呈长梭形，紧密排列形成典型均匀分布的BMSCs簇状增生(图1a);第2代以后细胞的形态比较均一(图1b)。转染后在胞浆内有细小的褐色颗粒沉积，24 h后少量细胞死亡，死亡细胞变圆，漂浮于培养基中(图1c)。

　　2.3 MTT法检测转染基因对BMSCs增殖活性的影响 A、C组分别为：0.6057±0.043、0.9350±0.0260，见表1。

　　2.4 RT-PCR检测 C组TGF-β1和Ⅱ型胶原的mRNA表达明显高于A组(P<0.01)。TGF-β1 mRNA表达以C组最多，A组次之，两组间比较差异有统计学意义(P<0.01);Ⅱ型胶原mRNA表达，C组也明显高于A、B、D、E组(P<0.01)，见表1。表1 TGF-β1、IGF-1、Ⅱ型胶原mRNA及蛋白表达注：C组与A、B、C、E组比较，P<0.01

　　2.5 Western blot检测 C组TGF-β1和Ⅱ型胶原表达明显高于A、B、D、E组(P<0.01)。TGF-β1蛋白表达以C组最多，A组次之，两组间比较差异有统计学意义(P<0.01);Ⅱ型胶原的蛋白表达，C组也明显高于A、B、D、E组(P<0.01)。见表1。

　　3 讨论

　　分离BMSCs的方法有密度梯度离心法、贴壁细胞分离法、流式细胞仪和免疫磁珠分离法[7~9]。作为组织工程种子细胞，细胞纯度越高越能符合组织工程研究的要求。我们将密度梯度离心法与贴壁培养法相结合，用比重为1.073 g/ml的percoll分离液分离BMSCs，具有操作简便、快速、实用等优点，是一种较理想的分离纯化方法[10]。Palmer等[11]报道，TGF-β1基因转染BMSCs能明显促进其向软骨细胞分化，在体内稳定释放的生长因子能较好地维持软骨细胞表型，防止其老化退变。田甜等[12]利用软骨细胞和BMSCs共培养取得了很好效果。TGF-β1联合软骨细胞共培养，诱导BMSCs向软骨细胞分化，具有协同作用[13，14]。近年来共培养成为热点。张勇等[15]用脂肪干细胞和软骨细胞共培养后，诱导分化为软骨细胞。刁华建等[16]用GAM成功诱导BMSCs向软骨细胞分化。我们的实验研究表明：(1)经转染后的BMSCs成功表达软骨细胞的特异性基质Ⅱ型胶原，具有软骨细胞特征;(2)在细胞外基质的表达量上，以基因转染复合共培养组最多，说明BMSCs向软骨细胞转化的能力要明显高于其他组;复合共培养才是符合机体真实内环境的需求，并有助于提高疗效。这是一个很有前景的方向，对于组织工程软骨应用于临床具有重要意义。

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