Literature
首页医源资料库在线期刊中华现代外科学杂志2010年第7卷第6期

结直肠绒毛-管状腺瘤中HPV感染的基因分析

来源:中华现代外科学杂志
摘要:【摘要】目的研究人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus,HPV)在结直肠绒毛-管状腺瘤中的感染情况以及此肿瘤与人乳头瘤病毒感染的关系。方法从南京中医药大学第三附属医院病理科的83例结直肠绒毛-管状腺瘤的石蜡组织中提取16、18型人乳头瘤病毒的基因,采用聚合酶链反应进行基因扩增检测,并对其患者进行临床病理资......

点击显示 收起

【摘要】  目的 研究人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)在结直肠绒毛-管状腺瘤中的感染情况以及此肿瘤与人乳头瘤病毒感染的关系。方法 从南京中医药大学第三附属医院病理科的83例结直肠绒毛-管状腺瘤的石蜡组织中提取16、18型人乳头瘤病毒的基因,采用聚合酶链反应进行基因扩增检测,并对其患者进行临床病理资料分析。 结果 83例结直肠绒毛-管状腺瘤石蜡组织标本中总的人乳头瘤病毒的感染率为57.83%。结论 结直肠绒毛-管状腺瘤与人乳头瘤病毒感染有关,结直肠人乳头瘤病毒的高感染部位为直肠及乙状结肠。

【关键词】  绒毛-管状腺瘤;人乳头瘤病毒;聚合酶链反应;感染率; 结直肠

  Analysis on HPV infection among 83 patients with colorectal villus-tubiform adenoma

  GUO Xiao-chuan, GENG Jian-xiang, ZHANG Jin-hao,et al.Department of Pathology, Third Affiliated Hospital of Nanjing Traditional Chinese Medical University, Nanjing 210001, China

   Objective To study the HPV infections among 83 patients with villus-tubiform adenoma and the relationships between villus-tubiform adenoma and human papillomavirus.Methods Based on the original pathology materials in department of pathology, third affiliated hospital of Nanjing traditional Chinese medical university,we mainly tested the villus-tubiform adenoma infected in 16,18 types HPV by means of PCR.Results The infection rate of HPV is 57.83% among 83 patients with colorectal villus-tubiform adenoma.Conclusion The high infection risk of HPV infection is in rectum and sigmoid colon among 83 patients with colorectal villus-tubiform adenoma.

  [Key words] villus-tubiform adenoma;human papillomavirus; polymerase chain reaction( PCR);infection rate; colorectum

  结直肠腺瘤是大肠黏膜上皮细胞增生的真性肿瘤,分为良性和恶性肿瘤,其单发者称为腺瘤。瘤体越大,恶变率越高。尤以绒毛状腺瘤最易恶变,其次是绒毛-管状腺瘤,管状腺瘤恶变较少。腺瘤发生以男性多于女性,随年龄增长,发病率增加。从尸检资料看,50岁以前腺瘤发生率仅为17%,50~59岁为35%,60~69岁则为56%,70岁以上者达63%。近年来,研究发现HPV感染与宫颈癌、肛周癌、口腔癌等密切相关,随着HPV基因检测设备、试剂的不断改进和优化,使其研究不断深入。由于HPV在结直肠癌的发生发展中起着重要的作用,使得HPV与结直肠癌的关系引起了人们的关注和重视。以往文献由于所采用的检测方法及试剂的敏感性不同,以致报道的感染率不一。本文采用目前最敏感的HPV检测技术,即实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR)技术,分组检测结直肠绒毛-管状腺瘤中HPV感染的型别及感染率,并对其进行分析。

  1 材料与方法

  1.1 材料 收集2009年1月-2010年4月间南京中医药大学第三附属医院全国肛肠医疗中心手术的83例结直肠绒毛-管状腺瘤患者的常规石蜡组织标本,其中,男49例,女34例;年龄20~84岁,平均58.68岁。由两位经验丰富主治以上的病理医师依据单一疾病诊断的病名按编号顺序随机选择蜡块,另取30例正常人肠黏膜石蜡组织标本作为对照。 同时复习其临床病理资料。

  1.2 方法

  1.2.1 石蜡组织切片 取每例患者的石蜡组织,以4~6μm进行切片,一般切取10~15片即可。用专用的镊子轻轻夹取,放入小试管中,切第2例患者的石蜡组织前,用次氯酸钠溶液擦刀片及镊子各3次。

  1.2.2 标本处理 加1ml二甲苯至以上小试管中,震荡10s,在12000rpm离心5min,去上清液,并重复以上步骤3次;将残留的二甲苯去除干净;再加入1ml无水乙醇,震荡10s,在12000rpm离心5min,去上清液。并重复以上步骤3次;将小试管放置通风处,将残留的乙醇挥发干净。加入蛋白酶K(蛋白酶K根据说明书配置浓度),震荡均匀,放入37℃恒温箱内过夜。

  1.2.3 DNA的提取 加500μl的蒸馏水到过夜的组织中,震荡混匀;加入DNA提取液50μl (采用上海复星医药科技发展有限公司提供的试剂盒),震荡混匀,放入金属浴内,100℃,停留15min。取上清液,按照试剂盒的使用说明书进行操作。

  1.2.4 PCR扩增 引物和探针的设计与合成:根据NCBI确定候选目的的基因片段序列,利用GenBank上提供的序列设计引物和探针(由上海复星医药科技发展有限公司合成),引物和探针见表1。表1 16、18型HPV荧光定量分析中的引物与探针注:表1序列中的H可代表A、C、T;Y可代表C、T、U;W可代表A、T

  1.2.5 PCR反应体系 将PCR反应体系(总体系30μl:样品4μl,配置的反应液26μl),加入毛细管中,放入TL-1890型(三通道)实时荧光定量PCR仪中进行扩增。具体设置参数见表2。

  1.2.6 统计学处理 将83例结直肠绒毛-管状腺瘤组织的石蜡标本及30例正常人肠黏膜石蜡组织标本检测得到的HPV感染的三种阳性结果,应用统计软件包SPSS 13.0,采用χ2检验分组进行数据分析。表2 16、18型HPV PCR反应的步骤、温度、时间及循环数在60℃时采集荧光信号,采集方式设为“SINGLE”。

  2 结果

  2.1 结果判断 阳性结果可诊断为HPV感染;阴性结果说明DNA的含量低于检测下限,但并不能排除含有其他型别HPV DNA的可能性。16、18型HPV定性结果判断的标准见表3。表3 16、18型HPV定性结果判断的标准

  2.2 结果分析 在83例结直肠绒毛-管状腺瘤组织中,结直肠绒毛-管状腺瘤总的HPV感染率为57.83%、直肠绒毛-管状腺瘤总的HPV感染率为66.67%、乙状结肠绒毛-管状腺瘤总的HPV感染率为68.00%,升、横、降结肠绒毛-管状腺瘤总的HPV感染率为36.00%,见表4。

  其中,由表4可见,16、18型HPV感染10例,其感染率为12.05%;16型HPV 感染18例,其感染率为21.69%;18型HPV 感染20例,其感染率为24.10%;无16、18型HPV感染35例,占总标本的42.17%。总的HPV感染率为57.83%,共48例。 结直肠绒毛-管状腺瘤以18型感染为主,其次为16型感染,16、18型混合感染率最低。 单一型别的感染率为45.78%,共38例,而混合型别的感染率为12.05%,共10例。表4 83例检测标本中HPV DNA阳性例数和阳性率检测结果

  本研究说明结直肠绒毛-管状腺瘤组织中存在着较高的HPV 感染,也说明HPV感染与结直肠腺瘤发生、癌变密切相关。在结直肠绒毛-管状腺瘤中,直肠及乙状结肠绒毛-管状腺瘤的HPV感染率最高,其次为升、横、降结肠。结直肠绒毛-管状腺瘤三组之间16、18型HPV DNA阳性率比较差异无显著性(P>0.05),而结直肠绒毛-管状腺瘤三组组织与正常人肠黏膜石蜡组织比较,16、18型HPV DNA阳性率差异均有显著性(P<0.05),提示结直肠绒毛-管状腺瘤组织中存在着较高的16、18型HPV 感染,结直肠绒毛-管状腺瘤瘤变和癌变与16、18型HPV的感染有着密切的关系。

  3 讨论

  腺瘤是管状腺瘤、绒毛状腺瘤和绒毛-管状腺瘤的总称。腺瘤的成熟期,从病理上分为3类:(1)管状腺瘤:又称腺瘤性息肉或息肉样腺瘤;(2)绒毛状腺瘤:又有称乳头状腺瘤,一般体积较大,癌变率30%~40%;(3)绒毛-管状腺瘤,表面部分光滑,部分粗糙,体积较大,癌变率仅次于绒毛状腺瘤[1]。

  临床上常将以上三种腺瘤也称为新生物或称具有癌前病变的腺瘤。腺瘤癌变的概念已被人们接受,于此过程中在腺瘤的腺上皮细胞内伴有一系列多基因的变化,多方面的现象说明其序惯性。从世界范围看,当移民至结直肠癌高发区的群体,其腺瘤癌变的发生率亦随之增加,癌变率与年龄及腺瘤大小呈正相关,有资料证实切除腺瘤可减低腺癌的发生率。从病理形态看仅部分腺瘤癌变,凡腺瘤体积大的,绒毛状及重度不典型增生的腺瘤易恶变[1]。研究显示:(1)小于1cm的腺瘤有1.3%恶变率,1~2cm之间的腺瘤仅9.5%发生恶变,大于2cm腺瘤的恶变率为46%;(2)管状腺瘤仅4.8%发生恶变,绒毛状腺瘤恶变率为40.7%;(3)腺瘤轻度的不典型增生有5.9%恶变率,腺瘤中度及重度不典型增生的癌变率则分别为18%及34.5%[1]。

  目前,研究认为大多数的结直肠癌存在着从腺瘤到癌的演变过程,这个过程大约在15~20年的期间。因此普遍认为结直肠腺瘤也是一种潜在的癌前病变。多数的腺瘤存在不典型增生,不典型增生的程度越重则与癌症越是接近。

  近年来发现,HPV与人类的各种良性和恶性增生性病变有关,且很可能就是这些病变的病因。与HPV感染相关的疾病主要为疣、尖锐湿疣、鲍温样丘疹、鳞癌、腺癌、疣状癌等。近年来,肛门直肠癌发病率呈明显增加的趋势,研究表明,肛门直肠恶性肿瘤的发生与HPV有着密切联系[2~7]。

  人乳头瘤病毒,分高危型、中危型、低危型,其中低危型包括HPV6、11、42、43、44等型别,常引起外生殖器湿疣等良性病变,高危型包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等型别,与宫颈癌、宫颈上皮内高度病变(CIN II/III)及其他恶性肿瘤的发生相关,尤其是HPV16和18型[2~7]。

  人乳头瘤病毒是人类明确的最重要的致癌病毒之一,它们在人群中极易传播扩散,除经性传播外,还可通过直接或间接接触传染,常与多种良、恶性肿瘤密切相关。研究结果表明结直肠癌HPV阳性率显著高于腺瘤,而腺瘤又明显高于正常组织。直肠腺瘤的癌变时间平均为7年[2~7]。

  从本研究来看,HPV18型感染率最高,HPV16型感染率其次,但两者感染率很接近,16、18混合型最低,由此我们可以推测HPV可能先感染结直肠绒毛-管状腺瘤,并潜伏于此类腺瘤中,当遇到协同致癌因子(化学、物理、生物因子)或患者出现免疫功能低下时,此病毒被激活,高水平表达,并诱发结直肠绒毛-管状腺瘤逐渐发生癌变[2]。由于本研究标本的数量不够大,需要进一步的大样本来检测绒毛-管状腺瘤中的HPV16、18型感染情况,并对此腺瘤的癌变过程中HPV的感染进行进一步的研究。由此可见,HPV感染很可能是结直肠、肛管及肛门区良、恶性肿瘤的致瘤致癌因子,同时也为我们开展结直肠、肛管及肛门区恶性肿瘤的病因学研究提供了思路和证据。值得我们对肛门、结直肠常见病变、癌前病变及癌组织进行HPV感染大样本的基因研究,以弄清其病毒感染与癌变的关系,为肛门、结直肠恶性肿瘤的防治提供依据[8,9]。并且把50岁以上、直径大于2cm的腺瘤、绒毛状腺瘤及重度不典型增生腺瘤的人群作为大肠癌筛查的重点,把大肠癌的发病率真正的降下来,造福于人类[2,8,9]。

【参考文献】
   1 Rasai J,回允中(主译). 阿克曼外科病理学(上卷),第9版. 北京:北京大学医学出版社,2006,799-810.

  2 耿建祥,王旭波. 人乳头瘤病毒检测及其临床应用. 北京:人民卫生出版社,2009.3 刘锡光,刘 忠,田厚文. 人乳头瘤病毒检测及其防治. 北京人民卫生出版社,2009.

  4 何桂蓉,何 林,李芳芳,等. 人乳头瘤病毒感染分子诊断的研究进展. 中华检验医学杂志,2006,29:1048-1049.

  5 何桂蓉,刘秋芹,龚文波,等. 双色荧光定量快速分型、定量高危型人乳头状瘤病毒. 中华微生物学和免疫学杂志,2007,27:762-765.

  6 王鲁平.人乳头状瘤病毒感染与子宫颈病变关系的研究进展及应对策略.诊断病理学杂志,2007,14(2):86-89.

  7 郎景和.迎接子宫颈癌预防的全球挑战与机遇.中华妇产科杂志,2002,37(2):129-131.

  8 Papaconstantinou HT,Lee AJ,Simmang CL,et al. Screening methods for high-grade dysplasia in patients with anal condyloma. J of Surg Res,2005,127:8-13.

  9 Giuliano AR,Tortolero-Luna G,Ferrer E,et al. Epidemiology of human papillomavirus infection in men,cancers other than cervical and benign conditionns. Vaccine,2008,26:17-28.

  

作者: 郭晓川,耿建祥△,张金浩▲,周 伟,孙继花 2011-6-29
医学百科App—中西医基础知识学习工具
  • 相关内容
  • 近期更新
  • 热文榜
  • 医学百科App—健康测试工具