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首页医源资料库在线期刊中华现代外科学杂志2011年第8卷第2期

外源性Noggin蛋白抑制人骨肉瘤细胞MG-63增殖性的体外试验*

来源:中华现代外科学杂志
摘要:【摘要】目的测定人正常成骨细胞株hFOB1。19和人骨肉瘤细胞株MG-63中内源性BMP-2、Noggin的表达水平及差异性,并观察不同剂量外源性Noggin蛋白在体外对骨肉瘤细胞株增殖性的影响。方法采用RT-PCR方法对两种细胞中内源性BMP-2、Noggin的mRNA表达水平进行检测,并应用MTT比色法检测不同浓度的Noggin外源性蛋白(1μ......

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【摘要】  目的 测定人正常成骨细胞株hFOB 1.19和人骨肉瘤细胞株MG-63中内源性BMP-2、Noggin的表达水平及差异性,并观察不同剂量外源性Noggin蛋白在体外对骨肉瘤细胞株增殖性的影响。方法 采用RT-PCR方法对两种细胞中内源性BMP-2、Noggin的mRNA表达水平进行检测,并应用MTT比色法检测不同浓度的Noggin外源性蛋白(1μg/ml、10μg/ml、20μg/ml浓度梯度)作用骨肉瘤细胞后,观察不同作用时间下的细胞活性。结果 与正常的人成骨细胞hFOB 1.19相比,人骨肉瘤细胞MG-63中的内源性BMP-2 mRNA表达水平明显增高,而Noggin mRNA表达水平无明显差异。外源性Noggin蛋白对MG-63细胞的生长有着明显的抑制作用,并且具有剂量和时间依赖性。结论 骨肉瘤细胞和正常成骨细胞之间存在BMP-2的差异性表达。体外环境下,应用外源性Noggin蛋白可以明显抑制骨肉瘤细胞的生长,并具有剂量和时间依赖性。

【关键词】  hFOB 1.19;MG63; BMPs;Noggin;细胞增殖

  Objective To detect the different expression of endogenic BMP-2 and Noggin protein between human normal bone cell line hFOB 1.19 and human osteosarcoma cell line MG63, and to study the effect of different dose of exogenous Noggin protein on the proliferation of human osteosarcoma cell line MG63 in vitro tests.Methods Detection of the mRNA expression levels of endogenic BMP-2 and Noggin protein in these two type of cells was performed by RT-PCR. MTT method was used to detect the effect of exogenous Noggin protein with different durg concentrations(1, 10 and 20 g/ml in different groups) on the proliferation of MG63 cells, then observation of the cytoactive under different action time was taken. Result The expression level of BMP-2 mRNA in the human osteosarcoma cell line MG63 was significantly high then it in the human normal bone cell line hFOB 1.19, but the different expression level of Noggin protein between these two type of cell lines was not significant. Exogenous noggin protein can inhibit the proliferation of MG63 cells, and an obvious timedependent manner or dose-dependent manner could be detected.Conclusion The expression level of BMP-2 between human normal bone cell and human osteosarcoma cell is significantly defferent. The proliferation of the osteosarcoma cells can be significantly inhibited by exogenous noggin protein in vitro,which can perform in a dose and time dependent fashion.

  [Key words] hFOB 1.19;MG63;BMPs;Noggin;cell proliferation

  骨肉瘤是一种好发于骨干骺端的高度恶性肿瘤,生长迅速,侵袭性强,转移早。研究表明骨形成蛋白(Bone Morphogenetic Proteins, BMPs)在骨肉瘤中有较为丰富的表达,可能在骨肉瘤发生、发展和转移中起着重要作用。Noggin 蛋白是一种BMPs 的细胞外特异性拮抗剂,通过与BMPs 特异性结合阻止BMPs 与细胞表面的受体结合,从而抑制BMPs 的功能。本实验通过检测不同剂量外源性Noggin 蛋白对人骨肉瘤细胞MG63 体外增殖的影响,探讨Noggin 蛋白抑制骨肉瘤细胞增殖活性的可能机制,为临床应用Noggin 治疗骨肿瘤提供实验依据。

  1 材料与方法

  主要试剂材料:正常成骨细胞hFOB1.19和人骨肉瘤细胞MG-63均购自中科院上海生命科学研究院细胞资源中心;重组人Noggin 蛋白购自深圳达科为公司(代理),纯度> 95%,表达方式为编码人Noggin蛋白前体( NP-005441.1 ) ( Met 1- Cys 232 )的DNA序列融于IgG1 C末端Fc区域;分子量为49.8kDa;PCR引物、DNA marker购自上海生工公司;MMLV逆转录酶、4DNA连接酶、TaqDNA聚合酶购自美国Promega公司;cDNA合成试剂盒购自美国MBI公司;二甲基亚砜(DMSO)、四甲基偶氮唑蓝(MTT)和胰蛋白酶均购自美国Sigma 公司;ham’s F12/DMEM培养基、Trizol试剂、细胞培养基MEM购自美国Gibco 公司。

  2 试验方法

  2.1 BMP-2/Noggin在人正常成骨细胞和人成骨肉瘤细胞中的表达

  检测正常成骨细胞hFOB1.19和人骨肉瘤细胞MG-63经冻存、复苏后,将MG-63细胞置于培养皿中用无酚红MEM培养液培养(其中含10%的胎牛血清,青霉素50u/ml,庆大霉素0.05g/L,pH值为7.2)。hFOB 1.19细胞置于培养皿中用无酚红ham`s F12/DMEM培养液培养(其中含10%的胎牛血清,青霉素50u/ml,庆大霉素0.05g/L,其pH值为7.2)。当上述细胞在培养皿中贴壁融合达80%左右时进行细胞传代培养,显微镜下进行细胞计数。收集hFOB1.19和MG-63细胞,采用异硫氰酸胍/酚/氯仿一步法提取总RNA。采用美国MBI cDNA合成试剂盒,每个反应体系20μl,进行cDNA合成,在-80℃冰箱保存备用。然后采取RT-PCR方法检测BMP-2和Noggin mRNA的表达情况,用GAPDH做内参照,以排除由于RNA降解所致目的基因不表达。PCR产物各取15μl用1.5%琼脂糖凝胶电泳,EB染色观察。一次性成像照相,各条带的光密度值用JVCky-F30B 3-CCD图像摄录输入仪输入,并用美国Bio-Rad公司的Quantity One 4.5图像分析系统分析。

  PCR引物序列如下:BMP-2 上游产物 5’ -TTGCGGCTGCTCAGCATGTT 3’下游产物 5’TCCGAGAACAGATGCAAGATG 3’扩增片段理论长度为 315bpNoggin 上游产物 5’ GCACCCAGCGACAACCTGCCC 3’  下游产物 5’ GCTGCCCACCTTCACGTAGCG 3’扩增片段理论长度为425bpGAPDH 上游引物 5’ ACCACAGTCCATGCCATCAC 3’下游引物 5’ TCCACCACCCTGTTGCTGTA 3’扩增片段理论长度为452bp

  2.2 外源性Noggin蛋白对人骨肉瘤细胞MG-63增殖的影响

  将细胞进行如下分组,进行细胞增殖性试验(MTT试验):A组 MG-63细胞B组 MG-63细胞+ 1μg/ml NogginC组 MG-63细胞+10μg/ml NogginD组 MG-63细胞+20μg/ml Noggin将对数生长期各组细胞,用0.25%胰蛋白酶消化,制成单细胞悬液(浓度为2×105/ml),分别接种到96孔培养板中,每孔100μl,各设3个复孔。在37℃,5% CO2,饱和湿度条件下培养24h。在各组培养24h、48h、72h、96h后,每孔加入20μl MTT溶液(5mg/ml),在37℃,5% CO2条件下培养4h,吸去上清,每孔加100μl终止液异丙醇,37℃下培养30min。每孔加150μl DMSO,振荡10min,使结晶物充分溶解后,酶标仪下570nm波长(参考波长630nm)测定A值,每组3孔,重复3次;记录结果,以时间为横坐标,吸光度A值为纵坐标绘制细胞生长曲线,并计算细胞生长抑制率:细胞生长抑制率=(空白组A值-处理组A值)/空白组A值×100%。

  2.3 统计学处理

  统计学处理用SPSS 10.0软件完成,计量资料数据表示方式以平均值±标准差(Mean±SD),两组计量资料采用非独立样本Student’s t检验,多组计量资料采用方差分析。P<0.05为差异有显著性。

  3 结果

  3.1 各组细胞生长情况

  光镜下观察培养的hFOB 1.19细胞和MG-63细胞生长良好,单个细胞呈三角形或者短梭形,生长至融合后细胞排列紧密,呈栅栏状(图1和图2)。

  3.2 hFOB 1.19和MG-63细胞中BMP-2和Noggin的mRNA表达情况

  RT-PCR结果显示:两组细胞BMP-2 mRNA表达的相对含量(相对灰度值:目的条带灰度/相应列的内参条带灰度)分别为:hFOB 1.19细胞组:0.544±0.072;MG-63细胞组:0.847±0.086;MG-63细胞组BMP-2 mRNA的表达水平是hFOB 1.19细胞组的155.69%±19.71%,差异具有显著性(P<0.05)。两组细胞Noggin mRNA表达的相对含量分别为:hFOB 1.19细胞组:0.427±0.065;MG-63细胞组:0.514±0.062;MG-63细胞组Noggin mRNA的表达水平是hFOB 1.19细胞组的120.98%±12.51%,两组差异无显著性(P>0.05)(图3和图4)。图1 培养72h后的MG-63细胞生长状态(×10倍)图2 培养72h后的hFOB 1.19细胞生长状态(×10倍)图3 正常成骨细胞hFOB1.19和人骨肉瘤细胞MG-63中Noggin和BMP-2 mRNA的表达情况

  图4 正常成骨细胞hFOB1.19和人骨肉瘤细胞MG-63中Noggin和BMP-2 mRNA的表达差异3.3 体外细胞增殖性实验 将MG-63细胞株单独及与浓度分别为1、 10、 20μg/ml的外源性人重组Noggin蛋白作用24h、48h、72h、96h后,MTT法测定吸光度A值,并计算肿瘤细胞生长抑制率。MTT检测结果显示:与未处理组(A组)相比,三种浓度的外源性人重组Noggin蛋白在各时间点上(除B组在24h时)均可明显抑制人骨肉瘤MG-63细胞的生长,并且抑制程度具有剂量依赖性(P<0.05)(图5)。培养96h后,三个处理组的生长抑制率分别为12.02%、37.76%、47.51%。具体吸光度和生长抑制率见表1和表2。图5 不同浓度外源性Noggin蛋白对人骨肉瘤细胞MG-63增殖性的抑制作用表1 不同浓度外源性Noggin蛋白对人骨肉瘤细胞MG-63增殖性的抑制作用 表2 不同浓度的外源性Noggin蛋白在不同时间点时对人骨肉瘤细胞作用的生长抑制率

  4 讨论

  目前的研究发现,骨肉瘤的发生与发展是多基因作用的结果,其发生、转移及预后与p53、KAI1、PTEN、Fas、FasL、MMP/TIMP 、erbB-2、MDR21、MMP29等基因的异常表达有关,这些基因的异常表达又会上调或下调多种细胞因子的表达,从而影响肿瘤细胞的各项生物学行为。其中BMPs就是一类在骨肉瘤发生、发展过程中起重要作用的细胞因子。

  骨形态发生蛋白(Bone Morphogenetic Protein, BMP)是转化生长因子-β(Transforming Growth Factor-β,TGF-β)超家族的成员,1965年Urist等首先研究发现BMPs能够在体内外诱导未分化间充质细胞向软骨、骨细胞发生不可逆的分化,形成新生的软骨和骨组织。虽然BMPs最初是作为一种骨诱导因子被发现,但后来的研究发现BMP在胚胎生长发育、促进细胞分化和增生、创伤愈合甚至在肿瘤的发生、发展及转移等方面也都有重要的作用。Ye等[1]的研究发现在前列腺癌细胞中,肝细胞生长因子可以通过调节BMP受体表达水平的提高而达到促进肿瘤生长、转移的功能。Xu等[2]等发现BMP-2对肝细胞的增殖有抑制作用。

  因大部分骨骼系统的恶性肿瘤都发生在骨骼发育期,并且BMPs是骨骼系统发育的最重要生长因子,因此对BMPs在骨肉瘤发生、发展、侵袭、转移等方面的作用一直是研究的热点。多项试验对骨肿瘤中的BMP表达情况进行了研究。结果显示骨肉瘤中存在BMP-2的高表达,且这种BMP-2高表达可能与肿瘤恶性程度有关[3~6]。

  BMP及其受体不仅在骨肉瘤细胞中有所表达,还和骨肉瘤的生物学行为密切相关。董绍忠等[7]应用BMP单抗和免疫组化方法检测骨肉瘤中BMP蛋白的表达;并应用增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的单抗对骨肉瘤的增殖活性进行检测,发现75%的标本有BMP表达,有BMP表达的骨肉瘤有较高的增殖活性;应用BMP单抗体外可以对骨肉瘤细胞系OS-732细胞产生生长抑制。范清宇等[8]用反义人BMP-2逆转录病毒表达载体转染人骨肉瘤细胞OS-9901,结果可造成骨肉瘤细胞增殖活性的降低。本试验通过RT-PCR方法对人成骨肉瘤细胞系MG-63以及正常成骨细胞hFOB1.19中的BMP-2和Noggin mRNA的表达量进行了测定。结果显示,与正常成骨细胞hFOB1.19相比,人成骨肉瘤细胞系MG-63中的BMP-2 mRNA水平有显著升高(P<0.05),Noggin的mRNA水平无显著差异。本研究的结果与既往文献中报道的骨肉瘤组织免疫组化检测结果相似,表明骨肉瘤细胞中存在BMP-2的高表达,提示BMP-2可能与骨肉瘤的恶性生物学行为有关。

  研究表明,Noggin 是BMP的一种特异性直接拮抗剂。Noggin 和BMPs 结合后会形成一个较大的戒指样结构,这种结构可使Noggin有效地将BMPs 上的受体结合位点遮蔽,从而抑制BMPs与其受体结合。Li等[9]的研究显示Noggin可通过拮抗BMP-2/4抑制新皮质神经元的分化,并使微管相关蛋白阳性细胞的突起减少。Finley等[10]的研究则显示Noggin与BMP-4调控胚胎干细胞向神经元的分化,Wang等[11]发现Noggin对干细胞的存活也具有重要作用。在肿瘤方面,Schwaninger等[12]的研究发现,在骨诱导性前列腺癌及乳腺癌细胞株中并不表达Noggin,加入外源性Noggin可降低细胞株的成骨活性,抑制了肿瘤骨转移的发生率。Freeley等[13, 14]的研究显示Noggin在体外试验中能够抑制成骨性和破骨性前列腺转移癌细胞的生长、增殖、侵袭和转移能力,并且应用过度表达Noggin的逆转录病毒载体还可以在体内明显抑制成骨性和破骨性前列腺转移癌病灶的大小。Kawabata等[15]也发现Noggin对MCO-Y4骨肉瘤细胞株的生长具有抑制作用。这些研究都提示BMP/Noggin这对分泌蛋白在细胞中的表达比例失衡,可能是导致细胞生物学行为发生改变的一个重要因素。本试验有关外源性Noggin蛋白抑制人骨肉瘤细胞MG-63增殖性的研究中,发现加入外源性Noggin确实可以显著抑制骨肉瘤细胞的生长,且Noggin对骨肉瘤细胞增殖活性的这种抑制作用存在着明显的时间和剂量依赖性,表明Noggin可以通过抑制BMPs来对肿瘤组织产生调节作用。其机制可能因外源性Noggin 蛋白与BMP结合从而抑制了BMP与其受体的结合,进而抑制了BMP 促进骨肉瘤细胞增殖方面的作用,具体机制尚需进一步研究。Noggin可能作为治疗表达BMP肿瘤的一种有效手段,为进一步研究Noggin治疗骨肉瘤的可行性提供了参考依据。

【参考文献】
   1 Ye L, Lewis-Russell JM, Davies G, et al. Hepatocyte growth factor up-regulates the expression of the bone morphogenetic protein (BMP) receptors, BMPR-IB and BMPR II, in human prostate cancer cells. Int J Oncol,2007,30(2):521-529.

  2 Xu CP, Ji WM, van den Brink GR, et al. Bone morphogenetic protein-2 is a negative regulator of hepatocyte proliferation downregulated in the regenerating liver. World J Gastroenterol,2006, 12(47):7621-7625.

  3 Arihiro K, Inai K. Expression of CD31, Met/hepatocyte growth factor receptor and bone morphogenetic protein in bone metastasis of osteosarcoma. Pathol Int, 2001,51(2):100-106.

  4 Gobbi G, Sangiorgi L, Lenzi L, et al. Seven BMPs and all their receptors are simultaneously expressed in osteosarcoma cells. Int J Oncol,2002,20(1):143-147.

  5 平飞云,黄宏杰,任晓冰.BMP-2在颌骨骨肉瘤中的表达及其临床意义.实用肿瘤杂志,2004,19(6):479-482.

  6 Guo W, Gorlick R, Ladanyi M, et al. Expression of bone morphogenetic proteins and receptors in sarcomas. Clin Orthop Relat Res,1999,(365):175-183.

  7 董绍忠,岳文,杨连甲.BMP-2 mRNA在颌骨骨肉瘤及软骨肉瘤中的扩增及其对肿瘤增殖活性的影响.现代口腔医学杂志,2000,1:17-18.

  8 范清宇,岳文,杨连甲,等.转染反义人BMP-2逆转录病毒表达载体对骨肉瘤细胞生长的影响.实用口腔医学杂志,2001,5:381-385.

  9 Li W, LoTurco JJ.Noggin is a negative regulator of neuronal differentiation in developing neocortex.Dev Neurosic,2000,22(1~2):68-73.

  10 Finley MF,Devata S,Huettner JE.BMP-4 inhibits neural differentiation of murine embryonic stem cells.J Neurobiol,1999, 40(3):271-287.

  11 Wang G,Zhang H,Zhao Y,et al. Noggin and bFGF cooperate to maintain the pluripotency of human embryonic stem cells in the absence of feeder layers. Biochem Biophys Res Commun,2005,330(3):934-942.

  12 Schwaninger R, Rentsch CA, Wetterwald A,et al. Lack of noggin expression by cancer cells is a determinant of the osteoblast response in bone metastases. Am J Pathol,2007, 170(1):160-175.

  13 Feeley BT, Krenek L, Liu N, et al. Overexpression of noggin inhibits BMP-mediated growth of osteolytic prostate cancer lesions. Bone,2006,38(2):154-166.

  14 Feeley BT, Gamradt SC, Hsu WK, et al. Influence of BMPs on the formation of osteoblastic lesions in metastatic prostate cancer. J Bone Miner Res,2005,20(12):2189-2199.

  15 Kawabata A, Yamamoto K, Lan NT, et al. Establishment and characterization of a cell line, MCO-Y4, derived from canine mammary gland osteosarcoma. J Vet Med Sci,2006, 68(10):1047-53.

  

作者: 曹 东1,马俊明2△ 2011-6-29
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