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【摘要】 某制药厂为预防制药车间可能发生的微生物污染问题，对该厂制药车间(洁净室)空气、环境、工作人员、原料等各个环节进行了为期一个月的微生物学采样检验。结果表明，产生微生物污染的因素是多方面的，但其中工作人员没有严格执行操作规范，自身携带的微生物是导致微生物污染的主要因素，建议制药厂今后要加强管理工作，严格执行各项规章制度。避免此类情况的再次发生。
【关键词】 制药厂 ;制药车间;污染菌
AbstractA pharmaceutical factory pharmaceutical workshop for the prevention of possible microbial pollution,did the microbiological sampling inspection in the pharmaceutical factory workshop ( clean room) air, environment, personnel, materials and other aspects for a month. The results showed that microbial contamination, resulted in many factors, but the staff did not strictly enforce the operating norms, their microorganisms is the main factors leading to microbial contamination. We recommend for future to strengthen the management of pharmaceutical factory, strict implementation of the rules and regulations to avoid such situations happen again.
Key wordspharmaceutical; pharmaceutical workshop; contaminating bacteria
某制药厂为通过国家标准认证，进行了几次内部质量监测，但制药车间(百级洁净室)的微生物指标一直不过关。为了解究竟是何原因导致的微生物污染，特邀请本检测中心联合进行调查检测，分析主要的污染微生物种类，进行初步的微生物溯源分析，以找出生产流程中存在的环节漏洞，避免今后可能的微生物污染。
1实验材料与方法
1.1检测仪器和试剂普通营养琼脂平板、孟加拉红营养琼脂选择性培养基、增菌液和VITEK32(bioLIASON CC3/CC4 全自动微生物分析仪)、GPI+鉴定卡、GNI+鉴定卡、氧化酶反应试剂均由生物梅里埃中国有限公司提供。微量生化管由浙江省军区后勤卫生防疫检验所提供。默克MAS-100空气浮游菌采样器由上海优浦科学仪器有限公司提供。
1.2实验过程
1.2.1车间空气检验采样方法和地点设置主要参考《医药工业洁净室(区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》(GB/T 16292~16294-2010)[1]和《药品生产质量管理规范(2010年修订)》[2]这两种标准，检测空气中的浮游微生物。共设置16个采样点，如图1所示，使用MAS-100空气浮游菌采样器，设置高度为1.5m的人群呼吸带，时间4min，采样流量为20L /min。琼脂包括用于细菌的普通营养琼脂平板(直径9cm)和用于真菌的孟加拉红营养琼脂平板(直径9cm)两种，每种2块。采样时间2011年4月15号和5月15号共2次。培养时间参考ISO 14698-1 2003《生物污染控制总则》[3]，即普琼平板经(36±1)℃倒置培养48h后，再置于室温之下倒置培养72h;真菌平板则经(28±1)℃倒置培养96h培养后，再置于室温之下倒置培养72h;然后选择每个生长良好的单个菌落进行转种纯化，最后得到的纯菌株使用VITEK32进行种属判定。图1制药车间布局
1.2.2制药车间环境考虑到检测目标表面平滑，且该车间并不生产抗生素或其他抑菌品，因此表面污染微生物测定决定采用平板接触压印法[2]，培养时间同样使用ISO 14698-1 2003《生物污染控制总则》[3]。最后得到的纯菌株使用VITEK32进行种属判定。采样时间和浮游菌检测相同，2011年4月15号和5月15号共2次，采样目标包括门把手、台面、通风口等，如表1所示。表1制药车间采样目标
1.2.3工作人员因考虑到检测目标表面并不平整，所以采样采用规格板棉签拭子涂抹法[2]，根据制药车间操作流程，选择采取3位操作人员，采样和浮游菌检测同时进行，采样时间2011年4月15号和5月15号共2次，采样目标包括操作人员双手手套、操作服头套、口罩、拖鞋底等见表2。琼脂采用普通营养琼脂和孟加拉红营养琼脂两种，每种两块。培养时间参考ISO 14698-1 2003《生物污染控制总则》[3]，最后得到的纯菌株使用VITEK32进行种属判定。表2工作人员采样目标
1.3 实验结果与分析
1.3.1制药车间空气一共128块平板，其中超净台2个监测点均未检出污染菌，16块空白。另4号和5号采样点各有1块空白，真菌只有2块生长，剩余46块普琼平板，均有1~3个菌落，经分离，纯化，转种，共计分离检测出22种112株可辨认的环境菌株和1种真菌2株。从检测结果初步来看，药车间空气中主要以葡萄球菌属(Staphylococcus)为主，分离数目和种类最多，包括表皮葡萄球菌、耳葡萄球菌、华纳氏葡萄球菌等，计 5种45株，占114株总数的39.5%。 芽孢杆菌属(Bacillus)，包括蜡样芽孢杆、枯草芽孢杆菌等，计4种36株，占114株总数的31.6%，居第二位。不动杆菌属(Acinetobacter)，包括醋酸钙不动杆菌等，计3种10株，占114株总数的8.8%。其余微球菌属(Micrococcus sp)、假单胞菌属( pseudomonas sp)、莫拉菌群(Moraxella)、棒状杆菌属 (Corynebacterium sp)等数量和种类都比较单一，可归类为一类，10种21株，占114株总数的18.4%。另外还有2株真菌，占114株总数的1.8%。
1.3.2制药车间环境
一共128块平板，其中超净台台面也均未检出污染菌，16块空白。真菌只有两块生长，剩余52块普琼平板，均有1~3个菌落，经分离、纯化、转种，共计分离检测出共计分离检测出25种121株可辨认的环境菌株，另有2种2株真菌。从检测结果初步来看，，相较制药车间空气，在制药车间环境中菌落组成变化不大。还是以葡萄球菌属(Staphylococcus)为主，分离数目和种类最多，包括表皮葡萄球菌、模仿葡萄球菌、木糖葡萄球菌、华纳氏葡萄球菌等6种54株，占123株总数的40.7%。芽孢杆菌属(Bacillus)多了一些，包括蜡样芽孢杆、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌等6种44株，占123株总数的39.0%，居第二位，估计跟沉降到桌面地面等环境后的生存能力比较强有关。 不动杆菌属(Acinetobacter)，包括鲁氏不动杆菌、醋酸钙不动杆菌等，计4种8株，占123株总数的6.5%。其余微球菌属(Micrococcus sp)如藤黄微球菌、假单胞菌属(pseudomonas sp)、泛菌属(Pantoea Gavini et al)、莫拉菌群(Moraxella)、棒状杆菌属 (Corynebacterium sp)等数量和种类都比较单一，可归类为一类，11种15株，占123株总数的12.2%，因为培养温度和培养时间的关系，平板上出现了真菌，但数量很少，仅有2株，占123株总数的1.6%。
1.3.3工作人员一共采集3个工人，192块平板，其中孟加拉红琼脂有4块生长，普琼平板96块，均有1~4个菌落。经分离，纯化，转种，共计分离检测出21种162株可辨认的环境菌株和3种真菌4株。从检测结果初步来看，在工作人员身上，葡萄球菌属(Staphylococcus)是三种环境条件中分离数目和种类最多的，包括表皮葡萄球菌、模仿葡萄球菌、木糖葡萄球菌、华纳葡萄球菌、溶血葡萄球菌、头状葡萄球菌等，共计8种85株，占166株总数的51.2%，可能跟口罩、头套靠近人体有关。芽孢杆菌属(Bacillus)仍旧是第二位，包括蜡样芽孢杆、枯草芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌，共计4种35株，占166株总数的21.1%。不动杆菌属(Acinetobacter)，包括鲁氏不动杆菌、醋酸钙不动杆菌、不动杆菌洛菲生物型等，计3种8株，占166株总数的4.8%。其余微球菌属(Micrococcus sp)、假单胞菌属 (pseudomonas sp)、克雷伯菌属( klebsiella)、放线杆菌属(Actinobacillus sp)、黄杆菌属 (Flavobacterium sp)棒状杆菌属( Corynebacterium sp)等数量变化较大，种类略有增加，归类为一类统计，15种34株，占166株总数的20.5%，因为培养温度和培养时间的关系，平板上有真菌，但数量很少，仅有3种4株，占166株总数的2.4%。
1.3.4污染情况分析从最终结果来看，环境中数量比例最高的是葡萄球菌属，主要包括表皮葡萄球菌、模仿葡萄球菌、木糖葡萄球菌等，都属于常见的人体正常携带菌群[4]，它们在三种环境条件中的大量检出和构成比例相近，某种程度上说明了工人对环境的影响和污染。如果将三种环境条件中的葡萄球菌属进行统计学分析的话，结果见表3。表3三种环境条件下葡萄球菌属的组成比较
H0:三种环境下葡萄球菌属组成比相同;H1:三种环境下葡萄球菌属组成比不全相同;α=0.05。使用EXCEL2003，按公式计算后查表得知，χ2检验值为3.968516，实际P值为0.137483，P>0.05，不拒绝H0，还不能认为三种环境下葡萄球菌属组成比不全相同。统计学结果说明操作工人携带的葡萄球菌污染菌群和车间空气，地面的微生物种群具有一定程度的相关性。环境中数量比例次高的是芽孢杆菌属，同样进行统计学分析的话，结果见表4。表4三种环境条件下芽孢菌属的组成比较
2实验结果探讨
近年来药品的微生物污染越来越受到全社会重视，在1993—1998年间，美国FDA报告的由微生物污染引起的召回案件就已经达到1370件，占全部产品召回案件的36%。我国药品微生物污染的调查数据较少，但微生物污染仍居首位，2008年的“刺五加事件”和2009年“双黄连注射液”事件 造成了严重的后果和无法挽回的损失[5]。这也促使全社会进一步关注药品微生物污染的管理和控制。药品作为特殊的商品，其质量直接关系到患者的身体健康和生命安危，而制药车间的洁净度又是影响药品质量的重要因素之一。制药车间的环境如果受到污染,药品质量就难以保证,这样生产出的药品将会延误或者加剧患者的病情，带来严重的身体危害和恶劣的社会效应。所以药品制药车间的污染控制对于药厂来说是必须严格重视的。从这次实验结果来看，制药车间的污染微生物种群，比如具有代表性的葡萄球菌属和操作人员身上自身携带的微生物群落比较类似，具有一定程度的相似性。这也比较符合很多文献报道的结论：微生物随着操作人员容易进洁净环境，最可能成为污染的主要来源，占90%左右。据有关文献报道：一般男性每人每分钟向周围排放1000个以 上的含菌粒子，女性为750个以上。穿衣服时，静止态发菌量为10~300个/(min·人)，行走时的发菌量为900~2500个/(min·人)。咳嗽一次发菌量为70~700个/(min·人)，喷嚏一次为400~600个/(min·人)[6，7]。可以说，通常情况下，操作人员是洁净区最大的潜在污染源。按照正常生产规定，把属于一般标准区域的人和物引进到有洁净级别要求的控制区或洁净室，就需要有提升人和物洁净水平的措施，即物要脱外包装，经除尘处理;人要更衣换鞋(也属除尘处理)。但经我们调查，在实际工作中，常常出现轻视规章制度，贪图方便的行为。如工人穿着净化服到无洁净级别的原料库取原料放在传递窗中，又回到有洁净级别的称量间称量，再进入有洁净级别的制药间制药，不经任何过渡处理就在不同洁净级别的车间内“串来串去”，这就成为洁净间重要的污染来源。还有的新工人因防护服、口罩不舒服而乘管理人员不备拉开透气，也有的是长时间工作后导致口罩鼻夹松动或脱落。或者是技术人员随手带着笔记本进出车间而不经传递窗消毒。由此可见，要预防微生物污染，针对这种惰性心理，首先就要严格执行各项规章制度，在洁净室中，人的数量和活动应有特别严格的限制。其次，更衣换鞋的小间和传递窗也要注意灭菌，保证洁净度的可靠性。并建立严格的卫生制度，督促操作人员养成良好的卫生习惯。操作人员上班不要戴手表之类的饰物、不涂指甲油。在生产中不串岗，防止把自身污染带到其他作业区。不要边生产边高声谈笑，以致唾液横飞，污染药品，养成上岗后、用餐后以及便后洗手的良好习惯。定期洗头、理发和男性刮胡须能够减少对药品的污染危险。工作服也应符合要求， 光滑，不掉纤维、无静电。平整，易清洗，耐腐蚀，使用后应尽快清洗干净，保持清洁干燥。口罩要把口和鼻子盖住，头发不得外露，要全部塞在工作帽内。全部服装应每2天由专人在厂控制区内洗涤1次。还有，操作人员要建立健康档案，必须保证每年的健康检查，患有传染病或隐性传染病及外伤溃疡等患者不能在直接接触药品的岗位上工作。患病痊愈后上班的工人要经医生健康检查确诊已经恢复正常状态后，才可上岗操作。该次实验，数量和种类名列第二的污染菌是芽孢杆菌属，作为环境当中最为常见的、抵抗力最强的污染菌群，它的大量出现，说明该厂的消毒净化还存在一定问题，笔者认为该厂制药车间的环境消毒工作很可能还不够彻底，旧菌反复污染洁净环境，仅靠洁净室内部消毒措施可能起不到排除污染的作用，要对洁净室送风系统等可能的污染源污染进行全面调查清洁。本次实验价值主要在于通过检测分析药品制药车间(洁净室)常见的污染微生物种类，进行初步的微生物溯源分析，以找出生产流程中存在的环节漏洞，避免今后可能的微生物污染。这些实验数据也有助于该药厂主动建立实验室环境微生物信息库，动态监控环境微生物的变化、建立环境微生物污染趋势分析图并预测微生物污染方向。使得企业从被动的排查污染措施上升到主动的预防、预警，将污染信息并与历史污染物比对，回顾调查，帮助质量体系的改进。同时该调查结果也可作为其他药品生产单位参考的资料，为生产厂家和监督部门分析污染原因时提供参考信息和源头控制，为建立更全面的药品质量体系和风险管理体系提供有效的分析手段。
【参考文献】
1中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会.医药工业洁净室(区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法 GB/T 16292~16294-2010.北京：中国标准出版社，2009：5，1.
2卫生部.药品生产质量管理规范(2010年修订) . 2010,10,19.
3《生物污染控制总则》ISO 14698-1 2003 洁净室及其相关控制环境技术委员会，ISO/TIC 209.
4 贾文祥，陈锦英，江丽芳.医学微生物学.北京：人民卫生出版社，2005.
5中药注射剂不良事件引发的监管对策思考. 中国医药导刊,2009(4).
6许钟麟.洁净室设计.北京：地震出版社，1994.
7郁庆福.现代卫生微生物学.北京：人民卫生出版社，1995.