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【摘要】 道地药材和非道地药材在形态、生药性状及化学成分等特征上具有高度相似性，因而传统的鉴别方法对道地药材的鉴别往往不易。本文首次将扩增片段长度多态性技术（AFLP，amplified fragment length polymorphism）应用到中药材道地性的鉴别中，绘制不同产地中药材的AFLP指纹图谱和遗传多样性，确定道地性产区药材的特异性差异带，从而区分道地药材。在此基础上，将AFLP标记转换成简单实用的SCAR（特征性片段扩增区域，sequence characterized amplified region）标记。将SCAR标记片段进行胶回收，PCR或克隆测序，然后根据序列特点设计特异性引物，通过简单的PCR，即可鉴别道地性产地中药材。在资源调查、鉴定研究的基础上，建立中药材道地性评价体系，为最终从分子生物学水平上建立中药材道地性的统一质量控制标准，提供简便、快速、准确的鉴别技术。
【关键词】 中药材；道地性；AFLP；SCAR；鉴别
Application of the AFLP combining with SCAR to identify the geoherbalism of traditional Chinese medicines
HAO Ming-gan， LIU Zhong-quan.
Jiangsu Provincial Key Laboratory of Coastal Wetland Bioresources and Environmental Protection， Department of Biology， Yancheng Teachers College， Yancheng， Jiangsu 224002，China
【Abstract】 The characters from morphologic and pharmacognosy and chemic components are high similar beteen genuine and ungenuine crude drugs. It is very difficult to identify the geoherbalism of the crude drugs with traditional methods. In this paper， we first applied the technique of the amplified fragment length polymorphism (AFLP) to distinguish the geoherbalism of traditional Chinese medicines. Fingerprint maps of crude drugs from different regions were drawn， and the specific bands from genuine crude drugs were determined. Thus， genuine crude drugs would be distinguished. Consequently， the specific bands of AFLP were turned into the sequence characterized amplified region (SCAR) markers. This specific fragment was purified， and sequencing by PCR or cloning. Then， basing on the sequence， the specific primers were designed. The geniune crude drugs would be distinguished by PCR. The evaluated systems will be established with regard to the geoherbalism of traditional Chinese medicines basing on resource investigate and authentication research. It may provide a simple， convenient and accurate method with seting up the control criterion of the geoherbalism of traditional Chinese medicines at the level of the molecular biology.
【Key words】 traditional Chinese medicine;geoherbalism;AFLP;SCAR;authentication
对中药道地性的认识源远流长，《神农本草经》中就有“土地所出，真伪新陈，并各有法”的记载，强调了区分产地，讲究道地的重要性［1］。
1 中药材道地性国内外研究现状
几千年来，道地药材一直是人们防治疾病的有力武器，但是由于历史的限制，科学技术发展水平的影响，历代对中药材“道地性”的认识局限在产地、生态、性状、功用等方面多有人为的因素，未能揭示其本质和规律。现代科学技术的发展为揭示中药材道地性的本质和规律提供了必要的手段。目前对道地药材的研究已经取得一些成绩。国内中药材道地性研究的传统方法主要从药材生药、生态和药理等性状、显微特征的变异、特征性的药用成分分析、同工酶和可溶性蛋白电泳的聚类分析、道地性产地药材和土壤中微量元素分析、紫外谱线、红外指纹图谱等理化性质来鉴别，种类包括黄连、板蓝根、红花、半夏、鱼腥草、茅苍术、吴茱萸、宁夏枸杞、阳春砂仁、山药、牛膝、丹参等药材［2～15］。南方协作组和北方协作组对中药品种的整理和质量的研究做了大量工作，其中包括部分具有道地性的常用中药。
由于道地性和非道地性药材在形态和生药性状等特征上的差异常不明显，这给应用传统方法鉴别道地药材带来了困难。近年来应用DNA分子标记技术研究药用植物道地性的形成和道地药材的鉴定已引起广泛的关注，并取得了一些有价值的研究成果。其中主要应用RAPD、核rDNA ITS区和5S rRNA基因间隔区序列比对等技术［16］。国内外最早运用DNA分子遗传标记对中药材品种鉴别的报道是香港中文大学Cheung等用AP-PCR方法对西洋参、人参的鉴别研究［17］。Yamazaki等从4种不同产地的甘草属植物商品药材中提取总DNA，RAPD分析鉴定了4种不同产地的甘草［18］。Zhang等利用AP-PCR方法对采自不同地区的党参（Codonopsis pilosula）药材进行分析，表明来自同一地区的党参样品有相似的DNA指纹图谱，而不同地区的党参样品有不同的DNA指纹图谱，并说明RAPD和AP-PCR可以用来对中药材产地的鉴别［19］。Kohjyouma等用RAPD方法对来自不同产地的苍术类4个种和1个变种进行了遗传变异分析，并结合气相色谱分析揭示了A. Laccea存在着较大的种内变异［20］。他们又用RAPD方法研究了当归及其变种，表明该方法是鉴别当归及变种的有效方法［21］。国内陈林姣等用RAPD技术鉴别了溪黄草类原植物，认为该方法对药材的“地道性＂研究有重要意义［22］。还有将RAPD技术运用于枸杞、黄芩、当归、厚朴、姜黄、冬虫夏草、丹参、连翘、牛蒡子等药用植物道地性研究的报道［23～31］。
应用DNA测序技术研究药材道地性。Mizukami等对产于日本的当归两变种、一个栽培品种的5S rRNA基因间隔区进行了PCR扩增和测序，结果表明，5S rRNA基因间隔区在当归种内无变异［32］。李萍等测定金银花5S rRNA基因间隔区序列认为不同居群间有差异［33］。蔡金娜等探讨了不同分布区的蛇床的ITS序列变异与其地理分布和化学成分的相关性，表明ITS-2序列的变异与中国产蛇床的纬度分布相关，而其与蛇床化学型的关系尚需作进一步研究［34］。
由于RAPD对DNA模板质量要求较高，由于药材DNA有不同程度降解，影响RAPD反应结果，重现性较差，其鉴别标准在不同的实验室难以稳定地重复，在药材鉴别的应用上有一定的局限。由于不同产地药材的遗传性状基本一致，因此特定的基因序列没有差异，而不同居群基因之间的间隔区序列变异非常小，如5S rDNA和rDNA间隔区。因此必须寻找新的分子标记方法。通过寻找道地药材特异性的DNA分子标记，以保证研究结果的可靠性。利用DNA分子遗传技术直接分析药材的DNA多态性，找出道地药材特征性的DNA 片段，进行测序，设计相应的特征性引物，来检测药材道地性。
从目前的研究状况看，对大多数道地药材的研究多为单方面的零散研究，较少进行多学科的系统研究，未能阐明其道地性的科学内涵和客观规律，以致难以对各个道地药材进行科学的质量评价，造成药材市场品种混乱、以劣代优等现象。由此，应加强具有道地性常用中药品种因生长在不同环境中形成的道地性和非道地性进行深入研究，通过本草考证、生态环境、种植管理、采收加工、炮制学、化学成分、药理学、临床应用和药源开发以及现代分子生物学等多学科的系统研究和质量评价，逐步揭示道地药材“道地性”的本质和规律，建立其道地性的评价指标体系，促进中医药学发展。
AFLP（扩增片段长度多态性技术，Amplified fragment Length Polymorphism）结合SCAR（特征性片段扩增区域，Aequence Characterized Amplified Region）技术可以在中药材道地性的研究上克服以上技术所带来的不足。本文对这种技术做简要概述。
2 AFLP结合SCAR分子标记技术
AFLP是在RFLP和RAPD的基础上发展起来的，结合了他们各自的优点，不管所研究的基因组DNA有多么复杂，理论上讲，AFLP方法都可以检出任合DNA之间的多态性。为了使中药材道地性研究过程更为简单易行，在AFLP的基础上，把道地性药材的特异性标记片段转化为SCAR标记，通过特异性引物进行PCR，即可鉴别出道地性药材。
2.1 基本原理及一般过程 AFLP 技术基于选择性扩增完全酶切消化后的基因组DNA 片段。该技术主要包括4个步骤（图1）：（1）DNA的准备，即DNA的酶切以及人工合成的寡核苷酸接头连接。（2）选择性扩增酶切片段。AFLP引物包括与人工接头互补的核心序列（CORE）、限制性内切酶识别序列（ENZ）和3′端选择性碱基三部分。（3）AFLP标记的统计。AFLP产物通过聚丙烯酰胺变性凝胶电泳（SDS-PAGE）检测样品的多态性，筛选出道地药材的特异性标记片段。（4）道地药材的SCAR标记特异性引物设计和鉴定。从凝胶中回收道地药材的特异性片段，通过PCR或克隆测序，根据特异性片段的DNA序列，设计出鉴定道地药材的特异性引物，研制出道地性药材的高特异性PCR鉴别试剂盒。
2.2 技术关键
2.2.1 引物筛选 建立AFLP分析体系后，首先从许多AFLP引物中筛选出多态性较高、带型质量较好、分辨率较高的引物。引物具有放射性或荧光标记。
2.2.2 道地性药材特异性片段确定 从众多的AFLP多态性条带中筛选合适的特异性或差异性条带，只有适合大小的片段（约250～500bp）才能有利于道地中药材的鉴定，因为中药材的DNA大多有些降解。
图1 AFLP结合SCAR技术流程简图 略
2.2.3 凝胶中回收道地药材的特异性片段 据此设计出鉴定道地药材的特异性引物，研制出道地性药材的高特异性PCR鉴别试剂盒。
2.3 技术特点
2.3.1 DNA需要量少 分析仅需要少量的DNA ，且部分降解的样品也可用来分析，但样品必须很纯，没有扩增的抑制物存在。
2.3.2 可重复性好 分析基于电泳条带的有或无，高质量的DNA和过量的酶可以克服因DNA的酶切不完全而产生的失真，PCR中较高的退火温度和较长的引物可将扩增中的错误减少到最低限度，因而该技术具有很强的可重复性。
2.3.3 多态性强 分析可以通过改变限制性内切酶和选择性碱基的种类与数目，来调节扩增的条带数，具有较强的多态分辨能力。
2.3.4 样品适用性广 该技术适用于任何来源和各种复杂度的DNA，如基因组DNA、cDNA、mRNA、质粒、某一个基因或基因片段，且不需要预知这些DNA 的序列特征。
3 结论
AFLP结合SCAR技术具有快速、高效、简便且实验结果稳定可靠，易于标准化，AFLP分子标记鉴定技术也已在很多农作物、蔬菜和水果等的品种鉴定中成功的应用［35， 36］。RAPD、AFLP 多态性转变成SCAR标记的研究方法也已在优良品种的鉴定中得到应用［37， 38］。
将AFLP结合SCAR标记的分子技术运用到道地性药材鉴定研究中，并设计出特异性PCR鉴别引物和鉴定试剂盒，从分子水平上解决传统方法对中药材道地性鉴定的困难。在资源调查、鉴定研究的基础上，为从分子生物学水平建立中药材道地性的评价指标体系，提供技术保障。
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基金项目：江苏省科技厅社会发展基金资助(编号：BS2001016)
作者单位： 224002 江苏盐城，江苏省滩涂生物资源与环境保护重点建设实验室， 盐城师范学院生物系
(编辑：秋 实)