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【摘要】 目的 建立肺炎清口服液的质量标准。方法 采用TLC法对本品中麻黄、苦参、丹参、前胡、栀子进行定性鉴别。采用RP-HPLC法，测定了方中主药黄芩中主要有效成分黄芩苷的含量。用ODS C18柱，流动相为甲醇－水－磷酸（53∶47∶0.0282），检测波长278nm。结果 在薄层色谱中检出麻黄、苦参、丹参、前胡、栀子；色谱斑点清晰，阴性对照无干扰；黄芩苷在进样量0.408～2.040μg范围内进样量与峰面积积分值呈良好的线性关系，回归方程为Y=3.29×107X-1.85×105，r=0.9999。平均加样回收率为100.49%（RSD=1.7%，n=5），肺炎清口服液中黄芩苷平均含量为5.042mg/ml。结论 所建立的方法可靠，结果稳定，重现性好，简便可行，为肺炎清口服液质量控制提供了方法。
【关键词】 肺炎清口服液；薄层色谱法；高效液相色谱法；黄芩；黄芩苷
Studies on quality standard of Fei-Yanqing oral liquid
FENG Han-ge，WU Wen-ru.
Hubei Provincial TCM Hospital， Wuhan 430061，China
【Abstract】 Objective To establish a quality standard of Fei-Yanqing oral liquid.Methods Fructus gardeniae， Herba ephedrae， Radix peucedani， Radix salviae miltiorrhizae， Radix sophorae flavescentis were identified by thin-layer chromatography， and baicalin in Scutellaria baicalensis Georgi， was determined by RP-HPLC. An ODS C18 column was used. The mobile phase was methanol-water-phosphoric acid (53∶47∶0.0282). Detection wavelength was 278nm. Results The TLC spots were developed fairly clear， and the blank test showed no interference; A good linearity was showed at the concentration range of 0.408～2.040μg of baicalin， the linear regression equation was Y=3.29×107X－1.85×105，r=0.9999， average recovery was 100.49%(RSD=1.7% n=5). Conclusion This method is reliable. The results are stable with a good repeatability and can be used for quality control of Fei-Yanqing oral liquid.
【Key words】 Fei-Yanqing oral liquid; TLC; RP-HPLC; Scutellaria baicalensis Georgi； Baicalin
复方肺炎清口服液是由黄芩、栀子、鱼腥草、龙胆草等11味中药组成，为湖北省中医院协定处方，临床上用于治疗小儿细菌性、病毒性肺炎，效果显著。为有效地控制其质量，采用薄层鉴别法对方中麻黄、苦参、丹参、前胡、栀子进行定性鉴别，并采用HPLC法对君药黄芩进行了含量测定，可有效控制制剂质量。
1 实验材料
1.1 仪器 美国 Waters600-2996 高效液相色谱仪（Empower化学工作站，PDA二级管阵列检测器）；精密PH计（梅特勒—托利多320—S）；KQ—100A型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；OHAUS万分之一电子天平；ZF-I型三用紫外分析仪（上海顾村光电仪器厂）。
1.2 试药 薄层用硅胶G（青岛海洋化工厂）；盐酸麻黄碱对照品及苦参、丹参、前胡、栀子对照药材均购于中国药品生物制品检定所；黄芩苷对照品（含量测定用，中国药品生物制品检定所 批号：715-9003）。肺炎清口服液（自制）。甲醇为色谱纯，水为重蒸馏水，其他试剂均为分析纯。
2 薄层定性鉴别
阴性对照液的制备：按处方比例配伍，除去被测药味，其他药味按样品制备工艺制得各种阴性样品，按待鉴别药味供试液制备项下方法制得阴性对照液。
2.1 麻黄的薄层鉴别（麻黄碱）［1］
2.1.1 对照品溶液的制备 取盐酸麻黄碱对照品用甲醇溶解制成5mg/ml的溶液，作为对照品溶液。
2.1.2 供试品溶液的制备 取肺炎清口服液20ml，加浓氨试液1ml使之成为碱性，用乙醚－乙醇（8：2）混合溶液提取2次，20ml/次，合并提取液；通过装有无水硫酸钠2g的漏斗过滤，滤液水浴挥干，残渣用甲醇5ml溶解，作为供试品溶液。
2.1.3 薄层层析 分别吸取上述2种溶液及阴性对照液各10μl，点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿－甲醇－浓氨试液（20：5：0.5）为展开剂。展至10cm，取出，晾干。喷以0.5％的茚三酮乙醇液。105℃烘约10min。结果：供试品色谱中，与对照品在相同Rf值处显相同红色斑点，阴性对照品此处无斑点显色。
2.2 苦参的薄层鉴别（苦参碱）［2］
2.2.1 药材对照液的制备 取苦参对照药材1g，加氯仿25ml，氨试液0.75ml，浸泡过夜，滤过，水浴蒸干，残渣用氯仿1ml溶解，作为药材对照液。
2.2.2 供试品溶液的制备 取肺炎清口服液10ml，加水至20ml，氨试液调pH至8.40，取15ml，用氯仿萃取3次，15ml/次，合并氯仿层，水浴挥干，残渣用氯仿2ml溶解，作为供试品溶液。
2.2.3 薄层层析 分别吸取上述2种溶液及阴性对照液各20μl，点于同一硅胶G薄层板上，以苯－丙酮－甲醇（8：3：0.5）为展开剂（展开缸预先用浓氨液饱和）展开至12cm处，取出晾干，喷以碘化铋钾液，结果：供试品色谱中，与对照药材在相同位置显相同砖红色斑点，阴性对照品在此处无斑点显色。
2.3 丹参的薄层鉴别（原儿茶醛）［2］
2.3.1 药材对照液的制备 取丹参对照药材2g，加适量水煎煮2次，30min/次，水煎液合并过滤，浓缩至10ml，加23ml无水乙醇使含醇量为70％，放置4h，取上清液，挥干乙醇至约10ml，用稀盐酸调pH至2.0，再用乙酸乙酯萃取2次，10ml/次，合并萃取液，用无水硫酸钠4g脱水，浓缩至2ml，作为药材对照液。
2.3.2 供试品溶液的制备 取肺炎清口服液10ml，加23ml无水乙醇使含醇量为70％，放置4h，取上清液挥干乙醇至10ml，用稀盐酸调pH至2，再用乙酸乙酯萃取2次，10ml/次，合并萃取液，用无水硫酸钠4g脱水，浓缩至2ml，作为供试品溶液。
2.3.3 薄层层析 分别吸取上述2种溶液及阴性对照液各20μl，点于同一硅胶G薄层板上，以苯－乙酸乙酯－甲酸（10：8：1.5）为展开剂，展开至15cm以上，取出晾干，喷以3％FeCl3 乙醇溶液显色，结果：供试品色谱中，与对照药材在相同位置显相同灰褐色斑点，阴性对照品在此处无斑点显色。
2.4 前胡的TLC鉴别［2］
2.4.1 药材对照液的制备 取前胡对照药材5g，加水10ml，煎1h，滤过，滤液浓缩成稠膏。加甲醇30ml，超声提取30min。滤过，滤液水浴挥干，残渣用甲醇2ml溶解，作为药材对照液。
2.4.2 供试品溶液的制备 取肺炎清口服液10ml，浓缩为稠膏，加甲醇30ml，超声提取30min。滤过，滤液水浴挥干，残渣用甲醇2ml溶解，作为供试品溶液。
2.4.3 薄层层析 分别吸取上述3种溶液各10μl，点于同一硅胶G薄层板上，用氯仿－甲醇（9：1）展开10cm，取出，晾干，置紫外光灯（365nm）下检视，结果：供试品色谱中，与对照药材在相同位置显相同蓝色荧光斑点，阴性对照品在此处无斑点。
2.5 栀子的TLC鉴别（栀子苷）［3］
2.5.1 药材对照液的制备 取栀子对照药材1g，加75％乙醇10ml，温水浴2h，滤过，取滤液，作为药材对照液。
2.5.2 供试品溶液的制备 取肺炎清口服液10ml，水浴挥干，加无水乙醇30ml，超声提取30min，过滤，滤液浓缩至5ml，作为供试品溶液。
2.5.3 薄层层析 分别吸取上述三种溶液各10μl，点于同一硅胶薄层板上，用乙酸乙酯－丙酮－甲酸－水（5：5：1：1）为展开剂，展至10cm，取出，晾干。喷以硫酸－乙醇液（5ml硫酸加乙醇至10ml），110℃烘约5min，结果：供试品色谱中，与对照药材在相同位置显相同蓝绿色、褐色斑点，阴性对照品在此处无斑点。
3 含量测定
3.1 色谱条件 色谱柱：Agilent Zorbax Extend C18柱（5μm，4.6mm×250mm）；流动相：甲醇－水－磷酸（53∶47∶0.0282），检测波长278nm，流速1.0ml/min，柱温25℃，进样量10μl。
3.2 溶液的制备
3.2.1 黄芩苷对照品溶液 精密称取经60℃真空干燥4h的黄芩苷对照品0.0102g，用甲醇溶解并定容为50ml，摇匀，制成浓度为0.204mg/ml的对照品储备液。分别取此溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0ml于10ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容为10ml，摇匀，制成浓度为0.0408、0.0816、0.1224、0.1632、0.204mg/ml的对照品溶液。
3.2.2 供试品溶液 精密吸取肺炎清口服液3ml，置25ml容量瓶中，加甲醇至约23ml，超声20min，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，取上清液用0.45μm微孔滤膜滤过，即得。
3.2.3 阴性对照溶液 按处方制备不含黄芩药材的样品，同3.2.2法制成阴性对照溶液。
3.3 检测波长的选择 分别取黄芩苷对照品液、样品供试液、阴性对照液于紫外分光光度计中在250～350nm范围内进行紫外扫描。由图谱可见在278nm处黄芩苷对照品液、样品液有最大吸收而阴性对照液无吸收，故以278nm为检测波长。
3.4 方法可行性考察 分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照液溶液各10μl，按上述色谱条件测定，记录HPLC图谱，结果阴性对照溶液对黄芩苷的测定无干扰，而且黄芩苷和其他组分可达到基线完全分离。
3.5 线性关系考察 取3.2.1项下的对照品溶液，各分别精密吸取10μl，进样3次，按上述色谱条件测定。以峰面积积分值为纵坐标Y，对照品进样量为横坐标X，得回归方程Y=3.29×107X-1.85×105，r=0.9999。表明黄芩苷进样量在0.408～2.040μg范围内有良好的线性关系。
3.6 精密度试验 精密吸取0.0816mg/ml的对照品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，在上述色谱条件下测定，重复进样5次，测得黄芩苷峰面积为4010015、3916204、4078701、4084871、4024037，RSD＝1.70％结果表明仪器精密度良好。
3.7 稳定性试验 精密吸取新配制的0.1224mg/ml的对照品溶液10μl，按样品测定方法分别间隔0、2、4、6、24h，进样测定峰面积，共测5次。统计结果对照品溶液中黄芩苷峰面积的RSD＝2.00％，表明对照品溶液在24h内稳定。
3.8 重现性试验 精密量取同一批的口服液3ml（共5份），分别按样品液制备及样品测定项下同法操作。计算黄芩苷含量，结果该批样品黄芩苷的平均含量为4.825 mg/ml，RSD=1.83%（n=5）。表明该方法重现性好。
3.9 回收率试验 采取加样回收法，精密量取已测得黄芩苷含量的同一个批号（031105）的样品5份，分别精密加入不同浓度的黄芩苷对照品溶液一定量，摇匀，按样品供试液制备项下同法操作，精密吸取上述5个不同样品供试液各10μl依法进样测定，计算黄芩苷回收率。结果平均回收率为100.49%，RSD=1.70%（见表1），表明本法具有良好的回收率。
表1 黄芩苷的回收率测定结果 略
3.10 样品的含量测定 取3个批号样品，分别按样品供试液制备项下同法处理后，进样10μl，依法连续进样3次，按外标峰面积法计算黄芩苷的含量，结果见表2。
表2 样品中黄芩苷的含量测定结果 略
根据3批样品测定结果，考虑到栀子药材质量差异，暂定本品含栀子苷不得低于2.500mg/ml。
3.11 投料用药材的含量测定 精密称取黄芩药材中粉0.3006g（另测定水分），按药典黄芩药材项下制样方法，制成供试品，在上述色谱条件下进样10μl，测定黄芩苷含量。结果：测得黄芩苷含量为0.0374mg/ml（n=3）。按药材含水量为14.09％（按中国药典2000年版一部附录ⅨH水分测定第一法）计算，相当于黄芩药材干燥品中黄芩苷含量为14.48％。符合药典规定（应不低于8％）。
4 讨论
丹参点样量为10μl，且展距在15cm以下时，斑点不清晰，样品分离拖尾。经过试验发现，点样量为20μl，展距超过15cm以上时，拖尾基本消除，斑点清晰。
含量测定实验中曾采用紫外分光光度法测定本制剂中黄芩苷的含量，不过在实践中发现由于本药为复方制剂，药味较多，成分复杂，干扰因素较多，在用紫外分光光度法测定含量时，准确性欠佳。为了更好地控制本品质量，后改用HPLC法对本药中黄芩苷含量进行了测定。该方法灵敏度高，测定准确、稳定，精密度好，回收率高，可用于肺炎清微型灌肠剂中黄芩苷的含量测定。
肺炎清口服液为中药复方制剂，成分复杂，测定干扰较大，曾参考文献方法对流动相进行选择，比较了不同的流动相系统，如甲醇－0.3％冰醋酸溶液［4］，甲醇－水，甲醇－水－磷酸［5～7］等，并分别考察了不同比例，认为甲醇—水—磷酸（53∶47∶0.0282），可有效排除其他成分的干扰，使样品中的黄芩苷分离度好，能准确测定黄芩苷的含量。
【参考文献】
1 药典委员会.中华人民共和国药典(一部).北京：化学工业出版社，2000，201，262.
2 高万山，刘松明.中药材理化鉴别手册.南京：南京大学出版社，1993，429.
3 王宝琴.中成药质量标准与标准物质研究.北京：中国医药科技出版社，1994，305，210，377，412，417.
4 张永林，凌云，江海身.反相高效液相色谱法测定流感退热冲剂中黄芩苷的含量.中国中药杂志，2001，26(5)：340.
5 卢全德，余南才，史自东，等.高效液相色谱法测定熊氏定喘口服液中黄芩苷的含量.中国中药杂志，2001，26(4)：275.
6 张林丽，黄雪梅.RP-HPLC法测定奇力咳感康口服液中黄芩苷的含量.中国药房，2001，12(2)：108.
7 路玫，谢东.高效液相色谱法测定利咽口服液中黄芩苷的含量.中国医院药学杂志，2000，20(6)：330.
作者单位：1 430061 湖北武汉，湖北省中医院
2 430061 湖北武汉，湖北中医学院
(编辑：宋 冰)