菊花脑保肝作用的有效部位筛选

　　【摘要】  目的  在菊花脑不同极性提取部位(CFDN)中筛选出保肝作用的有效部位。方法  采用0.1%CCl4(10ml/kg)ip小鼠，造成急性肝损伤的模型，测定血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)，观察肝组织病变；用CCl4损伤大鼠肝细胞，MTT法测定肝细胞增殖活性。结果  CFDN的60%乙醇和95%乙醇柱洗脱部位能显著降低小鼠CCl4肝损伤血清中ALT和AST的活性(P＜0.01，P＜0.05)，病理学观察显示：该部位能明显减轻肝损伤的程度(P＜0.01，P＜0.05)，CFDN的60%乙醇和95%乙醇柱洗脱部位能显著提高肝细胞活性，促进肝细胞增殖(P＜0.01)。结论  CFDN的60%乙醇和95%乙醇柱洗脱部位具有显著的保肝作用。

    【关键词】  菊花脑；有效部位；CCl4；肝损伤

    Screening of the active fractions from Chrysanthemum nankingense on their liver-protective effects

    REN Ai-nong,LIU Chun-yu,YANG Nian-yun.Jiangsu Provincial Institute of Traditional Chinese Medicine,Nanjing,Jiangsu Province Engineering Research Center For Pharmaceutial,Nanjing 210028,China

    【Abstract】  Objective  To screen the active fractions from Dendranthema Nankingense of Chrysanthemum nankingense on their liver-protective effects.Methods  The mouse models of carbon tetrachloride-induced acute hepatic injury were employed in this study.The activity of alanine aminotransferase(ALT)and aspartate aminotransferase(AST)in the serum were assaied.Also pathological changes were observed in liver tissues.The proliferous activities were assaied by MTT in cells of liver-injured rat by 0.1%CCl4(10ml/kg)ip.Results  The CFDN of 60% alchohol and 95% alchohol can debase ALT and AST activities in the serum of liver-injuried mice(P＜0.01，P＜0.05).This can elevate the activities of liver cells and accelerate hepatocellular proliferation.The pathological observation indicated the degrees of inflammatory activity in liver tissues were markedly reduced(P＜0.01).Conclusion  The results show that CFDN of 60% alchohol and 95% alchohol have highly antihepatotoxic effect.

    【Key words】  Chrysanthemum nankingense；effective site;carbon tetrachloride；hepatic injury

    菊花脑系菊科植物菊花脑(Chrysanthemum nankingense Hand-Mezz)的干燥嫩茎叶，为江苏地产资源，其味苦、辛，性凉；功能：清热解毒。该品种于2002年在江苏省科技厅自然基金立项，经研究，从该植物中提取分离得到12个化合物，主要为二十六烷酸、谷甾醇、金圣草黄素、木犀草素等，其中木犀草素是黄酮类的代表性成分［1］。该植物的不同极性部位经体内外抑菌、消炎、抗病毒的试验均显示出相应的活性部位。在此基础上我们对其保肝作用进行了探讨。采用0.1%CCl4(10ml/kg)ip小鼠，造成急性肝损伤的模型，测定血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)，观察肝组织病变以及用CCl4损伤大鼠肝细胞，MTT法测定肝细胞增殖活性，观察菊花脑不同极性部位(CFDN)的保肝作用。

    1  材料

    1.1  药物  菊花脑采集于南京老山，原植物经南京中医药大学刘训红教授鉴定为菊花脑(Chrysanthemum nankingense Hand-Mezz)，取菊花脑叶80%乙醇提取，提取物经石油醚萃取得提取部位A，母液上大孔树脂柱分别以20%乙醇、60%乙醇、95%乙醇洗脱，得提取物B、C、D(总黄酮含量分别为10%、50%、25%)。临用时用生理盐水或用二甲亚砜溶解。联苯双酯片(江苏鹏鹞药业有限公司)，临用时碾成细粉加生理盐水制成混悬液。

    1.2  试剂  CCl4分析醇(南京化学试剂厂)，以橄榄油稀释成0.1%溶液；四甲基偶氯唑盐(MTT，AMERSO分装)；谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)测定试剂盒(上海科欣生物技术研究所)；十二烷基磺酸钠(AMRESCO分装)；RPMI1640(Gico)；新生小牛血清(杭州四季青生物材料研究所)；大鼠肝细胞(中科院细胞生物所)。

    1.3  动物  昆明种小鼠，雄性，SPF级，16～20g，由苏州大学实验动物中心提供。

    2  方法

    2.1  ＣＣl4小鼠模型［2］与药物处理  小鼠随机分组，设正常组、损伤模型组、联苯双酯对照组(30mg/kg)、CFDN(A)、CFDN(B)、CFDN(C)、CFDN(D)组，CFDN组分设200mg/kg、400mg/kg两个剂量组。正常组和模型组ig生理盐水，其他各组ig相应药物，每天1次，连续6天。给药后第7天，除正常组给予等体积橄榄油外，其余各组小鼠ip 0.1% CCl4 0.1ml/10g，禁食，16h后摘取眼球取血，制备血清，测定血清ALT和AST活性；取肝左叶小块置10%福尔马林固定，进行苏木精—伊红染色，光镜下观察肝组织变化。

    2.2  细胞增殖测定  参照李跃华等MTT法［3］测定，肝细胞悬液调节细胞数为5×104/ml，于96孔板加细胞悬液，100μl/孔，根据添加药物及其浓度的不同分组，每组6个复孔。正常组加入RPMI-1640培养液；其余各组加入CCl4溶液至终浓度10mmol/L，试验组同时加入相应药物，24h后向培养板加入5mg/ml MTT溶液，每孔20μl，共同孵育4h后加入10%十二烷基磺酸钠100μl中止反应及溶解黑色结晶，放置12h后酶标仪于570nm波长处测定吸光度(A)值，反映细胞增殖活性。

    2.3  统计学方法  数据以(x±s)表示，采用SPPS10.0统计程序进行单因素方差分析处理，组间采用Dunnett方法比较，等级资料用Ridit检验。

    3  结果

    3.1  对CCl4肝损伤小鼠血清ALT和AST的影响  与正常组相比，模型组小鼠ALT和AST明显升高(P＜0.01)；与模型组相比，CFDN 60%乙醇洗脱部位大剂量组和CFDN 95%乙醇洗脱部位大剂量组小鼠血清ALT和AST明显下降(P＜0.01，P＜0.05)，提示CFDN 60%、95%乙醇洗脱部位对CCl4肝损伤小鼠血清ALT和AST活性升高均有明显的拮抗作用。见表1。

    3.2  对CCl4肝损伤小鼠肝组织病理变化的影响  光镜下病理观察结果，模型组小鼠肝细胞损伤严重，有点状坏死、浊肿、气球样变肝细胞，汇管区可见严重炎细胞浸润，细胞质内充满大量嗜伊红性较粗颗粒，严重者可见灶状坏死。CFDN 60%乙醇和CFDN 95%乙醇柱洗脱部位大剂量组小鼠肝细胞损伤明显减轻，可见少数点状坏死肝细胞和嗜酸性变肝细胞，其他各组小鼠肝损伤无明显改善。见表2。表1  CFDN对CCl4肝损伤小鼠血清ALT和AST活性的影响注：与模型组比较，P＜0.05，P＜0.01 表2  CFDN对CCl4小鼠肝组织病理变化的影响注：与正常组比较，ΔＰ＜0.01；与模型组比较，P＜0.05，Ｐ＜0.01

    3.3  对CCl4损伤大鼠肝细胞增殖活性的影响  与正常组相比，模型组大鼠肝细胞增殖活性明显降低(P＜0.01)，CFDN 60%、95%乙醇柱洗脱部位中剂量组、大剂量组与模型组相比，肝细胞增殖活性明显增加(P＜0.01)，其作用呈一定的量效关系。见表3。表3  CFDN对CCl4损伤培养大鼠肝细胞活性的影响 注：与CCl4组比较，P＜0.01；与DMSO组比较，P＜0.01

    4  讨论

    4.1  CCl4诱导的肝损伤模型是肝损伤药物疗效的标准模型  脂质过氧化是其主要的肝损伤机制。CCl4进入体内经肝药酶P450激活三氯甲基过氧自由基(·OOCCl3)和氯自由·Cl，引起生物膜脂质过氧化并与膜上脂质及蛋白质分子进行不可逆结合，导致肝细胞坏死，使细胞内转氨酶溢出进入血液从而造成血清中ALT、AST的活性升高。实验结果显示CFDN的60%和95%乙醇柱洗脱部位能显著降低小鼠血清ALT、AST的活性，对CCl4致小鼠急性肝损伤有明显的保护作用，这可能与该部位所含大量黄酮类成分结构上的酚羟基基团抗氧化功能有关，提示该部位为菊花脑保肝的有效部位。

    4.2  离体培养的大鼠肝细胞体外损伤模型  离体培养的大鼠肝细胞体外损伤模型，既可排除整体水平时神经体液的调节作用，又可排除离体器官水平时不同细胞之间的互相影响，从而可以观察各种药物对肝细胞的直接作用。大鼠肝细胞CCl4损伤后，细胞增殖活性明显降低，CFDN的60%和95%乙醇洗脱部位大、中剂量组显著促进肝细胞增殖，具有促进体外培养肝细胞生长的作用，从细胞水平进一步证实了CFDN对肝细胞保护作用。

    【参考文献】

    1  扬念云，任爱农，胡万春，等.菊花脑嫩茎叶的化学成分.中国药科大学学报，2005，36(5)：402-404.

    2  刘春宇，顾振伦，韩蓉，等.沙苑子黄酮对CCl4及D-氨基半乳糖致急性肝损伤的保护作用.中草药，2005，36(12)：1838-1841.

    3  李跃华，吴翠贞.丹参素增强肝细胞生长及其在药物性肝细胞损伤中的保护作用.南京医科大学学报，1996，16(4)：346-348.

   基金项目：江苏省科技厅资助项目(编号：BK2001184)

    作者单位： 1 210028 江苏南京，江苏省中医药研究院，江苏省现代中药制剂工程技术研究中心

    2 215007 江苏苏州，苏州大学医学院

　　 (编辑：宋  冰)