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【摘要】 目的 观察去卵巢所致肾虚骨质疏松症大鼠模型对小肠黏膜、肾组织CaBP-D9k、CaBP-D28k的mRNA及蛋白表达的影响，以及纳米钙补肾中药的疗效及其调控作用。方法 复制去卵巢所致肾虚骨质疏松症大鼠实验动物模型，按体重分层随机分为正常组、模型空白组、纳米钙补肾中药高、中、低剂量组、牡蛎碳酸钙阳性药物对照组、骨疏康阳性药对照组。灌胃给药12周。应用XR－36型双能X线骨密度仪测定股骨骨密度，DU640 核酸蛋白分析仪检测骨吸收指标-血清抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP），全自动生化分析仪检测骨形成指标-血清碱性磷酸酶（ALP），以评价动物模型的成立及药物疗效。检测小肠黏膜、肾组织CaBP-D9k、 CaBP-D28k的mRNA和蛋白表达，以探讨绝经后骨质疏松症发病机制及纳米钙补肾中药的疗效机理。结果 成功复制去卵巢所致肾虚骨质疏松症大鼠实验动物模型，模型空白组骨密度明显降低（P<0.01），血清TRAP、ALP活性均显著增高（P<0.01），符合高转换型骨质疏松症特点。模型空白组小肠黏膜CaBP- D9k mRNA、CaBP- D28k mRNA表达水平明显下降，CaBP-D28k的蛋白表达亦有同样趋势，而肾组织CaBP- D9k mRNA、CaBP- D28k mRNA及其蛋白表达明显升高。结论 提示绝经后骨质疏松症肠钙吸收减少，骨转化率增高，尿钙流失增加。应用纳米钙补肾中药具有明显防治效果，对钙代谢具有双向调节作用：明显上调小肠黏膜CaBP- D9k mRNA、CaBP- D28k mRNA及其的蛋白表达水平，即促进肠钙吸收增加；而肾组织CaBP-D9k mRNA、CaBP-D28k mRNA、CaBP-D28k的蛋白表达则有下调趋势，其作用机制与调整钙代谢平衡有密切关系。
【关键词】 骨质疏松症；CaBP-D9k；CaBP-D28k；纳米钙补肾中药
The mRNA and protein expression of CaBP-D9k, CaBP-D28k in the intestinal mucosa and kidney tissue of rats with osteoporosis due to kidney deficiency
ZHENG Hong-xin, WEI Hong, NIU Yu, et al.Liaoning University of TCM, Shenyang 110032，China
【Abstract】 Objective To observe the effect on CaBP-D9k、CaBP-D28k mRNA and protein expression in the intestinal mucosa and kidney tissue of rats with kidney deficiency type osteoporosis induced by ovariectomy, as well as the treatment effect and adjustable function of nanometer-calcium nourishing-kidney herbs. Methods Established the rat models with kidney deficiency type osteoporosis induced by ovariectomy, stratified by the different body weight and divided the rats randomly into normal group, blank model group, nanometer-calcium nourishing-kidney herbs （high, middle, low dosage） group, oyster calcium carbonate group （positive control group） and GUSHUKANG granule group （positive control group）. Administrated by gavage for 12 weeks. Detected the femur bone mineral density by using the dual energy X-ray absorptiometry, detected the bone reabsorption index-tartrate resistant acid phosphatase（TRAP） in blood serum by using the DU640 nucleic acid and protein analysis instrument and detected the bone formation effect-alkaline phosphatase（ALP） in blood serum by using the automatic biochemistry analyzer, to evaluate the establishment of the animal model and the therapeutic effect of drug. Detected the CaBP-D9k、CaBP-D28k mRNA and protein expression in the intestinal mucosa and kidney tissue, in order to explain the pathogenesis of the postmenopausal osteoporosis and the mechanism of the therapeutic effect of the nanometer-calcium nourishing-kidney herbs.Results The ovariectomized rat models with kidney deficiency type osteoporosis were established successfully. For the blank model group, the bone mineral density hadevident tendency to reduce（P<0.01）, the activity of TRAP、ALP in blood serum increased evidently（P<0.01）, which were coincident with the character of high-conversion type osteoporosis. The expression of CaBP- D9k mRNA, CaBP- D28k mRNA in the intestinal mucosa of model group decreased evidently, and there were the same tendency for the protein expression of CaBP-D28k, but the expression of CaBP- D9k mRNA, CaBP- D28k mRNA and the protein expression in the kidney tissue increased evidently.Conclusion The results indicate that for postmenopausal osteoporosis, the calcium absorption in the small intestine decrease, the conversion rate of bone rise and the running off of calcium in urine increase. There is distinctly preventing and treating effect by using nanometer-calcium nourishing-kidney herbs which has the two-way adjustment function for the calcium metabolism: there is significant up-regulation function for the expression of CaBP- D9k mRNA, CaBP- D28k mRNA and protein expression in the small intestine, that is: promoting the calcium absorption in the small intestine. For the expression of CaBP- D9k mRNA, CaBP- D28k mRNA and CaBP-D28k protein expression in the kidney tissue, there is down-regulation tendency. There is close relationship with regulating the balance of the calcium metabolism for the mechanism.
【Key words】 osteoporosis; CaBP-D9k; CaBP-D28k; nanometer-calcium nourishing-kidney herbs
随着人口老龄化，骨质疏松症发病率增加，骨折危险性增高，其发病机制和防治研究引起研究者的普遍重视。本研究以骨质疏松症钙代谢平衡失调作为切入点，探讨去卵巢所致肾虚骨质疏松症大鼠模型小肠黏膜、肾组织CaBP-D9k、CaBP-D28k的mRNA及蛋白表达变化，以及纳米钙补肾中药的疗效及其调控作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物 雌性Wistar大鼠，体重240～270g，4.5月龄，未曾交配。由中国医科大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（辽）2003-0009。动物购进后，饲养于环境温度为（20±1）℃，每日12h光照（7 Am～7 Pm）。给予普通饲料，配方为：玉米面40%，白面26%，麸子10%，豆饼10%，鱼粉10%，骨粉2%，盐1%及复合维生素1%。适应环境4天，进入实验状态。按体重分层随机分组，正常组18只，余者进行造模处理。
1.2 实验动物模型及其分组
1.2.1 肾虚骨质疏松症大鼠模型的建立方法 除正常对照组外，大鼠经肌肉注射盐酸氯胺酮（0.1g/2ml）进行麻醉（批号：030627），0.2ml/kg体重。手术从腰背部切除双侧卵巢。
1.2.2 动物分组 术后7天将卵巢切除组存活者按体重分层随机分组，即模型空白对照组、纳米钙补肾中药高剂量组、纳米钙补肾中药中剂量组、纳米钙补肾中药低剂量组、牡蛎碳酸钙阳性药物对照组、骨疏康阳性药对照组。
1.3 施加因素及给药方法
1.3.1 实验因素为纳米钙补肾中药 功效：益肾填精、补钙壮骨。处方组成：纳米钙（牡蛎）、鹿茸等。
阳性对照药：牡蛎碳酸钙（东盛科技启东盖天力制药股份有限公司，批号：CJ102），骨疏康颗粒剂（东港市康辰制药有限公司，批号：020305）。
1.3.2 给药方法 正常组、模型空白组，每天灌胃等体积的生理盐水。术后7天开始给药：实验组（中剂量组）、对照组用药等效剂量按成人用药量（g/kg）的6.3倍计算。纳米钙补肾中药中剂量组为2.1g/（kg·d），低剂量、高剂量分别为中剂量的1/3、3倍。牡蛎碳酸钙组（简称牡蛎钙组）为0.0063g/（kg·d），骨疏康颗粒阳性药对照组（简称骨疏康组）为2.1g/（kg·d）。上述各用药组 1次/d，各组给药容积为1ml/100g体重；每天上午给药，连续给药12周。
1.4 标本采集及制备
1.4.1 血清 分别采取腹主动脉取血5～8ml/只，门静脉血 1～2ml/只。室温静置4h内，用低速离心机3000rpm离心30min，取血清，分装，-70℃冰箱保存。
1.4.2 骨组织 取左后肢股骨，剔除肌肉及筋膜，生理盐水冲洗后，用塑料保鲜袋装好，置-70℃冰箱冻存备用。
1.4.3 小肠黏膜 无菌取小肠，生理盐水洗净，用玻片刮取肠黏膜，置于Trizol液中，另一部分，用锡铂纸包裹，迅速置于盛有液氮的容器中，-70℃冰箱冻存备用。
1.4.4 肾组织 无菌取左肾皮髓交界处，生理盐水洗净，置于Trizol液中，另一部分，用锡铂纸包裹，迅速置于盛有液氮的容器中，-70℃冰箱冻存备用。
1.5 骨质疏松症大鼠模型确立的评价标准
1.5.1 实验动物离体股骨骨密度的测定 应用XR－36型双能X线骨密度仪（美国NORLAND）及其所附的“The Small Subject Scout Scan”软件。
1.5.2 骨吸收指标 血清抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP），对硝基酚磷酸盐法，用DU640 核酸蛋白分析仪进行检测。
1.5.3 骨形成指标 血清碱性磷酸酶（ALP）测定，IFCC推荐方法，日立7600－020全自动生化分析仪进行检测。
1.6 指标检测及其方法 肠黏膜、肾组织CaBP-D9k、CaBP-D28K的mRNA和蛋白表达：肠黏膜、肾组织中总RNA制备，按照Trizol试剂说明书提取组织中RNA。
CaBP-D9k、CaBP-D28K引物由TaKaRa公司合成，以β-actin基因作为PCR的内对照。CaBP-D9k（462bp）,Sense:5’- CCA GGC TAC TGA CAC CAT；Antisense：5’- CTG AAC CAT CTT TCC ACC。CaBP-D28K（300bp），Sense：5’- CTG CTG CTC TTT CGA TGC；Antisense：5’- TCC ACG GTC TTG TTT GCT。 β-actin （700bp）， Sense：5’- GCC AAC CGT GAA AAG ATG；Antisense：5’- CCA GGA TAG AGC CAC CAT。
CaBP-D9k、CaBP-D28k的mRNA表达采用RT-PCR检测，蛋白表达采用Wersten blotting检测。
2 结果与分析
2.1 各组骨密度（BMD）变化的比较 见表1。离体股骨骨密度检测统计结果显示：与正常组骨密度比较，模型空白组有明显降低（P<0.01）；给药12周后, 与模型空白组比较，各组大鼠均有明显增高，差异有显著性（P<0.01，实验高剂量组P<0.05）。实验组和阳性对照组比较，实验中剂量组骨密度高于牡蛎钙组（P<0.05）。
模型空白组骨密度比正常组显著降低，说明骨质疏松症实验动物模型复制成功。而实验各剂量组及阳性药对照组均可以提高实验大鼠的骨密度值，证明其有效地改善了骨密度，对骨质疏松症防治的效果显著。表1 各组药物对肾虚骨质疏松大鼠注： 与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模空组比较，☆P＜0.05，☆☆P＜0.01;与牡蛎钙组比较，△P＜0.05,△△P＜0.01;与骨疏康组比较 ，◇P＜0.05,◇◇P＜0.01 （以下各表相同）
2.2 血清抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）和碱性磷酸酶（ALP）变化 见表2。血清抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）活性检测结果显示：与正常组比较，模型空白组血清抗酒石酸酸性磷酸酶活性显著升高（P<0.01）。给药12周后，与模型空白组比较，实验各剂量组、阳性药对照组均显著降低（P<0.01）。与阳性对照组比较，实验低、中剂量组均低于牡蛎钙组、骨疏康组（P<0.01）。
血清碱性磷酸酶（ALP）活性检测结果显示：与正常组比较，模型空白组血清碱性磷酸酶活性显著升高（P<0.01）。给药12周后，与模型空白组比较，实验低中剂量组、牡蛎钙组血清碱性磷酸酶活性均显著下降（P<0.01、P<0.05）。与阳性对照组比较，实验中、低剂量组血清碱性磷酸酶活性均低于牡蛎钙组（P<0.05）和骨疏康组（P<0.01）。
血清抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）活性为骨吸收指标，血清碱性磷酸酶（ALP）为骨形成指标，两项指标模型空白组均显著高于正常组，说明骨吸收、骨形成均增强，符合高转换型骨质疏松症特点。实验各剂量组和阳性对照组皆可降低TRAP、ALP，提示总体上可改善骨形成－吸收耦联。
2.3 各组小肠黏膜CaBP-D9k、CaBP-D28k的mRNA表达表2 各组药物对骨质疏松症大鼠血清TRAP和ALP活性的影响 注： （ ）为例数
2.3.1 RT－PCR检测小肠黏膜中CaBP-D9k mRNA的表达结果 PCR产物经琼脂糖电泳后，可分别于462bp（CaBP-D9k）、700bp（β-actin）见到条带（图1），与设计引物相符。正常大鼠小肠黏膜中含有CaBP-D9k mRNA表达。半定量RT－PCR显示（图2）：与正常组比较，模型空白组CaBP-D9k mRNA表达水平明显下降；给药12周后，与模型空白组比较，实验各剂量组、牡蛎钙组、骨疏康组均可明显上调CaBP-D9k mRNA表达水平。
M Marker 1正常组 2 模型空白组 3 实验低剂量组 4 实验中剂量组 5 实验高剂量组 6 牡蛎钙组 7 骨疏康组
图1 大鼠小肠黏膜组织CaBP-D9kmRNA RT-PCR及β-actin扩增产物琼脂糖凝胶电泳图图2 大鼠小肠黏膜组织CaBP-D9k
mRNA RT-PCR的结果分析2.3.2 RT－PCR检测小肠黏膜中CaBP-D28k mRNA的表达结果 PCR产物经琼脂糖电泳后，可分别于152bp（CaBP-D28k）、700bp（β-actin）见到条带（图3），与设计引物相符。正常组大鼠的小肠黏膜中可检测到CaBP-D28k mRNA的表达。半定量RT－PCR显示（图4）：与正常组比较，模型空白组CaBP-D28k mRNA表达水平明显下降；给药12周后，与模型空白组比较，实验中、低剂量组、骨疏康组均可明显上调CaBP-D28k mRNA表达水平。
M Marker 1 正常组 2 模型空白组 3 低剂量组 4 中剂量组 5 高剂量组 6 牡蛎钙组 7 骨疏康组
图3 大鼠小肠黏膜组织CaBP-D28kmRNART-PCR/β-actin扩增产物琼脂糖凝胶电泳图 图4 大鼠小肠黏膜组织CaBP-D28kmRNA /β－actin密度值的比较2.4 Western印迹杂交检测小肠黏膜中CaBP-D28k的蛋白表达 Western杂交结果显示：正常组大鼠小肠黏膜组织中可检测到CaBP-D28k的蛋白表达（图5）。Western blot 分析CaBP-D28k表达及显影胶片扫描的吸光度值（图6），与正常组比较，模型空白组大鼠小肠黏膜组织中的蛋白表达明显减弱；给药12周后，与模型空白组比较，实验各剂量组及阳性对照组均可不同程度上调CaBP-D28k蛋白的表达水平；其中纳米钙补肾中药中、低剂量组及骨疏康组上调幅度较大，以中剂量组效果最佳。
1 正常组 2 模型空白组 3 低剂量组 4 中剂量组 5 高剂量组 6 牡蛎钙组 7 骨疏康组
图5 大鼠小肠黏膜组织CaBP-D28k的Western blot结果
图6 大鼠小肠黏膜组织中CaBP-D28k蛋白表达示意图
2.5 各组肾组织CaBP-D9k、CaBP-D28k的mRNA表达
2.5.1 RT－PCR检测肾组织CaBP-D9k mRNA的表达结果 正常大鼠肾组织中有CaBP-D9k mRNA表达（图7）。半定量RT－PCR显示（图8）：与正常组比较，模型空白组CaBP-D9k基因表达水平明显升高。给药12周后，与模型空白组比较，实验各剂量组和牡蛎碳酸钙组，均可明显降低CaBP-D9kmRNA表达水平。
2.5.2 RT－PCR检测肾组织CaBP-D28K mRNA的表达结果 正常大鼠的肾组织中可检测到CaBP-D28k mRNA的表达（图9）。半定量RT－PCR显示（图10）：与正常组比较，模型空白组CaBP-D28K基因表达水平明显升高。给药12周后，与模型空白组比较，实验各剂量组及骨疏康组和牡蛎碳酸钙组均可明显降低CaBP-D28K mRNA表达水平。M Marker A 正常组 B 模型空白组 C 实验低剂量组 D 实验中剂量组 E 实验高剂量组 F 牡蛎钙组 G 骨疏康组
2.6 Western 印迹杂交检测肾组织CaBP-D28K的蛋白表达结果 大鼠肾组织中可检测到 CaBP-D28K的蛋白表达（图11）。Western blot 分析CaBP-D28K表达及显影胶片扫描的吸光度值（图12）：与正常组比较，模型空白组CaBP-D28K蛋白表达水平明显升高。给药12周后，与模型空白组比较，实验各剂量组及和骨疏康组、牡蛎碳酸钙组均可明显降低CaBP-D28K蛋白表达水平。
3 讨论
骨质疏松症类似于中医“骨痿”等疾病，辨证大部分基于肾虚，补肾是其主要治疗方法。骨质疏松症的病位不仅仅在骨和肾，而是生命复杂体系的整体病变，包括脾、小肠的运化失常以及髓海不足等。
已知绝经后骨质疏松症发病机制之一是与钙平衡紊乱密切相关。绝经时卵巢合成和分泌雌激素明显减少,骨吸收增加,骨量降低,骨矿盐和骨基质都减少,骨微结构渐破坏,日久发展为骨质疏松。绝经期和绝经后妇女的肠钙吸收随着年龄增加而缓慢下降,70岁时肠钙吸收率较青年时期减少近50%,肠钙吸收的减少主要由于维生素D缺少［1］。
CaBP一组受活性维生素D调节的细胞内蛋白质，因为与钙有高亲和力，所以在小肠和肾脏钙的细胞内转运过程中起着非常重要的作用。在哺乳动物能合成两种CaBP：CaBP-D9k和CaBP-D28k，主要分布在肠道、肾脏和子宫、胎盘等组织。绝经后妇女雌激素水平逐渐下降。肠钙吸收功能随着绝经的年限逐年下降，肠黏膜CaBP也明显减少的现象在一系列临床研究中得到证实［2］。这一现象也同时在动物实验上得到证实。肾脏远曲小管细胞内存在CaBP-D9k、CaBP-D28k和VDR［1,25（OH）2D3受体）、PMCA（ATP依赖性浆膜钙泵），VDR使钙进入细胞内，同时CaBP-D9k、CaBP-D28k、PMCA基因表达和蛋白合成增加，PMCA被激活，CaBP-D9k、CaBP-D28k与钙离子有很高的亲和力，作为钙的载体，使钙迅速扩散，负责钙在细胞内的迅速转运［3］。
有文献报道，雌激素可能通过钙结合蛋白参与钙在大鼠体内的代谢。研究发现，卵巢切除组，小肠黏膜CaBP-D9k的mRNA明显低于对照组；而卵巢切除后注射17－β雌二醇治疗组（0.5μｇ／100ｇ体重）未出现降低。17－β雌二醇可影响小肠黏膜CaBP-D9k的基因表达［4］。
在中医药防治骨质疏松症的研究中，中药复方黔岭藿合剂对去卵巢大鼠骨质疏松模型的作用，结果提示该合剂可使雌激素水平增加，促进钙结合蛋白（CaBP-D9k）合成，利于肠钙吸收，改善骨丢失状态［5］。补肾中药（抗骨松冲剂）能提高糖皮质激素致骨质疏松大鼠血清中1,25（OH）2D3的水平，促进肠钙的吸收，并能增强骨质疏松大鼠体内肠道CaBP-D9K基因的表达，进而纠正体内负钙平衡状态，抑制破骨作用，促进成骨作用［6］。对地塞米松和卵巢切除所诱发的骨质疏松模型及自然衰老的大鼠骨质疏松三种模型,给予中药治疗。结果显示：补肾方药提高小肠黏膜CaBP- D9k基因表达,从而使小肠黏膜钙结合蛋白（CaBP）的合成增加,促进小肠对钙的吸收［7］。本课题组的其他实验结果也表明, 正常大鼠小肠黏膜中有 CaBP-D9KmRNA 和蛋白表达；去卵巢组大鼠小肠黏膜组织中的 mRNA 和蛋白表达水平有明显的下调。纳米钙、纳米钙补肾中药各剂量组、钙尔奇600 组、骨疏康和 E2组用药后 12 周,与模型空白组比较,可不同程度上调肠黏膜组织中 CaBP-D9K的 mRNA 和蛋白表达水平,以纳米钙补肾中药剂量组作用较好［8］。
本实验对去卵巢所致肾虚骨质疏松症大鼠模型小肠黏膜、肾组织的CaBP- D9k、CaBP- D28k mRNA及蛋白表达水平进行了比较系统的研究。结果表明，去卵巢所致肾虚骨质疏松症大鼠模型呈现小肠黏膜CaBP- D9k mRNA、CaBP- D28k mRNA表达水平明显下降，CaBP-D28k的蛋白表达亦有同样趋势，提示绝经后骨质疏松症具有肠钙吸收减少；而肾组织CaBP- D9k mRNA、CaBP- D28k mRNA及其蛋白表达明显升高，这可能是由于大鼠切除卵巢后，雌激素水平明显降低，骨吸收和骨形成均增强，骨转化率增高，这直接导致骨丢失的增加。而人体内钙主要存在于骨骼中，骨丢失会造成骨钙和有机物从骨流向血液，并经尿排出，造成钙的大量流失。
应用纳米钙补肾中药进行防治具有明显疗效，对钙代谢具有双向调节作用：明显上调小肠黏膜CaBP- D9k mRNA、CaBP- D28k mRNA及其的蛋白表达水平，即促进肠钙吸收增加；而肾组织CaBP-D9k mRNA、CaBP-D28k mRNA、CaBP-D28k的蛋白表达则有下调趋势，其作用机制与调整钙代谢平衡有密切关系。
机体是一个有机的整体，五脏六腑生理功能密切相关，病理变化相互影响。因此，在骨质疏松症病理机制、中药调节作用效果的研究中，应立足于中医学整体、系统、宏观的思维，有效利用现代科学技术，以先进的研究方法和手段，揭示中医学理论科学内涵，提供理论和实验依据。
【参考文献】
1 孟迅吾. 钙与骨质疏松症. 中华内科杂志，2005，44（3）：235-236.
2 Morrms HA，Need AG，HoroiTzM，et al.Calcium absorPtion in normal and osteoporotic Postmeno Pausal women.Calcif Tissue Int，1991,49:240.
3 毛盟，王道聪. VD及CaBP一Ds在肠道和肾脏钙转运中的作用.国外医学·儿科学分册，1996，23（6）：289-292.
4 孔彦平，孟迅吾，周学瀛，等. 17-β雌二醇对去卵巢大鼠小肠黏膜钙结合蛋白基因表达的影响. 生殖医学杂志，1997，（4）： 199-202.
5 陶有略,方亮，叶大付,等. 黔岭藿合剂对大鼠卵巢切除诱发实验性骨质疏松症的影响.中国中医骨伤科，1996，4（6）：10-12.
6 刘和娣，李恩，刘崑.补肾中药对骨质疏松大鼠CaBP-D9k基因及表达的影响.中国骨质疏松杂志，1996，2（3）：62-64.
7 李恩，孔德娟,杨学辉,等. 补肾方药对骨质疏松防治的实验研究.中国骨质疏松杂志，2002，5（8）：166-168.
作者单位：110032 辽宁沈阳，辽宁中医药大学