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【摘要】 目的 观察复方通络胶囊对缺氧-复氧所致人脐静脉内皮细胞(HUVECs)损伤的保护作用。方法 体外培养HUVECs，建立缺氧-复氧模型，倒置显微镜观察细胞形态，采用MTT法测定细胞存活力，检测细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)水平。结果 复方通络胶囊能明显减轻缺氧-复氧所致细胞形态学的改变、抑制内皮细胞损伤、明显减少LDH的释放(P<0.05，P<0.01)。结论 复方通络胶囊对HUVECs损伤有明显的保护作用。
【关键词】 复方通络胶囊;内皮细胞;缺氧-复氧;保护作用
Protective effect of Fufangtongluo capsule on human umbilical vein endothelial cells with injury
XIAO Jing，WANG Jing-qing.Nanjing TCM University，Nanjing 210046，China
Objective
To observe the protective effect of Fufangtongluo capsule on human umbilical vein endothelial cells(HUVECs)injury caused by hypoxia-reoxygenation.Methods HUVECs were cultured in vitro to build the hypoxic-reoxygenation model，then we observed cell morphology by inverted microscope，and determinated cell viability by MTT，and detected lactate dehydrogenase(LDH)level in cell culture medium.Results Fufangtongluo capsule can significantly inhibit cell morphology change and endothelial cell injury caused by hypoxia-reoxygenation and effectively reduce LDH release(P<0.05，P<0.01).Conclusion Fufangtongluo capsule has obviously protective effect on human umbilical vein endothelial cells injury.
[Key words] fufangtongluo capsule;endothelial cells;hypoxia-reoxygenation;protective effect
缺氧-复氧在卒中、心肌缺血等疾病病理生理过程中扮演着重要角色[1]。复方通络胶囊是以滋养肝肾、化痰消瘀为法所制定的中药复方，由首乌、黄精、海藻、僵蚕、天麻等组成。前期研究表明其对大脑中动脉缺血再灌注(MCAO)大鼠有预防性脑保护作用。本研究通过体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs)，建立缺氧-复氧模型，观察细胞形态，采用MTT法测定细胞存活力，检测细胞培养液中LDH水平，探讨其对血管内皮细胞是否有保护作用。
1 材料与方法
1.1 药品、试剂 复方通络胶囊，生药1.5 g/ml，南京市中医院提供;丹参注射液，正大青春宝药业有限公司，批号：0502181;RPMI 1640培养基，Gibco产品;完全DMEM培养基，Gibco产品;二甲基亚砜
(DMSO)，上海凌峰化学试剂有限公司;新生牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司，批号：051120;胰蛋白酶(1∶250)，Amresco分装;乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号：20050304;连二亚硫酸钠(Na2S2O4)，上海化学试剂采购站经销，批号90878;MTT[溴化-(4，5-二甲-2-噻唑基)-2，5-二苯基四氮唑]，Amresco分装。
1.2 仪器 CK40倒置显微镜，OLYMPUS，JAPAN;超净工作台，苏州净化设备厂;DG3022A型酶联免疫检测仪，华东电子管厂产品;752分光光度计，上海光谱仪器有限公司。
1.3 实验细胞 HUVECs细胞，购于中科院上海细胞库。
1.4 方法
1.4.1 HUVECs的培养及氧化损伤模型的建立 HUVECs按常规方法复苏后接种于40 ml培养瓶中，培养液为含10%新生牛血清的RPMI 1640培养液，37 ℃、95%O2、5%CO2条件下培养，待细胞长满瓶底后，倒掉培养液，用PBS轻轻荡洗两次，加入0.25%胰蛋白酶37 ℃消化2～3 min，用新生牛血清终止消化，吸管轻轻吹打数次，使细胞完全分散，倒置显微镜下观察，计数，将细胞浓度调整为1×108个/L的细胞悬液，接种于细胞培养板上(96孔、24孔)同样条件下继续培养，待细胞长满单层融合后，弃去上清，以含0.5%血清的培养液培养24 h，使其同步化生长。HUVECs同步化生长后，换用无血清的1640培养液，除正常对照组外加入终浓度为1 mmol/L 的Na2S2O4 20 μl作用2 h，吸去培养液，用D-Hank’s液洗两次，然后加入无血清的DMEM 200 μl，继续培养24 h。
1.4.2 MTT比色法检测细胞存活力 96孔板每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl，37 ℃继续培养4 h。吸去上清液终止培养后，每孔加入150 μl DMSO，振荡5 min，在酶联免疫检测仪上，570 nm波长处测定各孔吸光度(OD值)。并根据下列公式计算药物对缺氧引起的内皮细胞损伤的抑制率：
抑制率=(OD给药组-OD模型组)/(OD对照组-OD模型组)×100%
1.4.3 LDH活性测定 各组HUVECs经缺氧处理后，收集培养液，参照南京建成生物工程公司LDH检测试剂盒说明检测。
1.5 实验分组 (1)正常对照组：加入无血清的1640培养液3 ml，正常条件下培养32 h。(2)模型组：加入无血清的1640培养液3 ml，缺氧24 h，复氧8 h;各给药组预先加入不同浓度的药物预孵1 h，然后按模型组处理。(3)丹参注射液组：丹参注射液(终浓度为3.0 g/L)，复氧8 h。(4)复方通络胶囊组：复方通络胶囊终浓度为1×10-4 g/L，复氧8 h。(5)复方通络胶囊Ⅱ组：复方通络胶囊终浓度为1×10-5 g/L，复氧8 h;(6)复方通络胶囊Ⅲ组：复方通络胶囊终浓度为1×10-6 g/L，复氧8 h。
1.6 统计学处理 数据以均数±标准差(〖x〗±s)表示，结果进行组间比较，采用t检验。
2 结果
2.1 HUVECs细胞形态学观察 正常对照组HUVECs细胞呈菱形、三角形或多角形，融合成片后的细胞呈鹅卵石状镶嵌排列。经缺氧-复氧处理后的模型组可见细胞间隙明显增宽，折光率下降，有的细胞肿胀变圆，多数细胞从培养瓶壁脱落而悬浮在培养液中，部分已经自溶。经复方通络胶囊预处理的HUVECs能明显地减轻缺氧-复氧对细胞形态学的改变，细胞形态完好，仍成片贴壁生长，细胞间隙无明显改变，部分细胞折光率降低，无明显的细胞皱缩肿胀变圆的现象，说明复方通络胶囊对HUVECs缺氧-复氧损伤具有一定的保护作用。结果见图1～6。
2.2 对HUVECs细胞存活率的影响 模型组细胞经缺氧-复氧处理后，OD570值明显降低，复方通络胶囊中、高剂量组OD570值均较模型组显著提高(P<0.05，P<0.01)，抑制率分别为56.99%、71.61%。结果见表1。表1 复方通络胶囊对HUVECs细胞存活率的影响注：与对照组比较，△P<0.01;与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01
2.3 对缺氧-复氧损伤所致HUVECs外漏LDH的影响 经缺氧-复氧处理后HUVECs外漏LDH增多，复方通络胶囊中、高剂量组可明显减少缺氧-复氧损伤所致LDH的释放(P<0.05，P<0.01)。结果见表2。表2 复方通络胶囊对HUVECs外漏LDH的影响 注：与对照组比较，△P<0.01;与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01
3 讨论
血管内皮细胞在调节止血功能、血管张力、细胞免疫、物质转运、生物活性物质释放、脂蛋白微粒的降解及维持血管结构等方面具有重要作用。作为血管壁与血流之间的屏障，当其受缺氧等因素损伤后，屏障功能受损，血液中脂质易渗入血管壁，当血管内皮剥脱、内皮下胶原组织暴露后，可引起血小板的黏附、聚集，并可引起血栓形成[2]。血管内皮细胞损伤时细胞形态发生变化，此时可见内皮细胞严重肿胀、脱落、细胞间隙增宽[3]。内皮细胞膜损伤时，MTT可透过损伤细胞膜而进入细胞，因此对血管内皮细胞进行MTT法测定可以反映存活的细胞线粒体的功能状态，用于反映存活的细胞数。缺氧可破坏细胞的有氧呼吸，从而引起一系列的损伤性改变。LDH从细胞内溢出是细胞坏死的标志之一，可通过LDH升高来估算细胞活力下降的程度[4]。研究表明与缺氧前相比较，内皮细胞的LDH活性均下降，且随缺氧时间的延长，LDH活性下降越明显[3]。
急性缺血性卒中或者短暂性脑缺血发作患者血清LDH升高[5]。脑缺血面积越大，细胞被破坏越多，血清LDH含量越高，监测LDH含量，不仅可以了解脑缺血的范围和轻重程度，而且可判断疾病的治疗效果[6]。
本实验通过对HUVECs细胞形态学观察，检测MTT的OD值和LDH的漏出量，可间接反映细胞缺氧-复氧后的损伤程度，以及复方通络胶囊抗缺氧-复氧损伤的能力。本实验结果表明，模型组细胞间隙明显增宽，细胞肿胀变圆，多数细胞从培养瓶壁脱落而悬浮在培养液中，部分已经自溶。模型组细胞对MTT的摄取能力明显下降，培养液中LDH漏出率明显高于对照组。而复方通络胶囊高、中剂量组，细胞上清液中的LDH含量明显减少，细胞对MTT的摄取能力有明显改善，细胞形态完好，细胞的死亡数明显减少，提示复方通络胶囊能够减轻缺氧-复氧所致的内皮细胞损伤，对血管内皮细胞具有保护作用，可能有益于缺血性卒中的治疗。
【参考文献】
1 Dhar-Mascareno M，Carcamo JM，Golde DW.Hypoxia-reoxygenation-induced mitochondrial damage and apoptosis in human endothelial cell by vitamin C.Free Radic Biol Med，2005，38：1311-1322.
2 王慧群，陈爱华.血管内皮与动脉粥样硬化.医学综述，2008，14(4)：598-600.
3 王岸柳，温祥云，刘国贞.急性缺氧对大鼠血管内皮细胞的损伤.首都医科大学学报，2004，25(2)：189-192.
4 Cechetti F，Rhod A，Simao F，et al.Effect of treadmill exercise on cell damage in rat hippocampal slices submitted to oxygen and glucose deprivation.Brain Research，2007，1157：121-125.
5 Lampl Y，Paniri Y，Eshel Y，et al.Cerebrospinal fluid lactate dehydrogenase levels in early stroke and transient ischemic attacks.Stroke，1990，21：854-857.
6 肖丽萍，黄益兴.急性脑梗死患者血清乳酸脱氢酶的测定及临床意义.脑与神经疾病杂志，2000，8(1)：54.