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【摘要】 目的 观察芪姑抑瘤煎药物血清(简称为QYJ)对人舌鳞癌Tca8113细胞的抗肿瘤作用。方法 应用血清药理实验方法，采用SRB法和集落形成法观察药物血清对Tca8113细胞生长的影响。结果 与正常空白小鼠血清相比，芪姑抑瘤煎药物血清能显著抑制培养的人舌鳞癌Tca8113细胞生长;随着给药剂量的增加，抑制作用增强，给药2～4h后的药物血清表现出更强的抑制作用，而给药8h血清对肿瘤细胞增殖无显著抑制作用。结论 芪姑抑瘤煎药物血清对人舌鳞癌Tca8113细胞的增殖有显著的抑制作用，芪姑抑瘤煎对口腔鳞癌的治疗作用可能是通过对肿瘤细胞的直接杀伤作用实现的。
【关键词】 芪姑抑瘤煎;SRB法;集落形成法;口腔鳞癌
Study on antitumor effect of 'Qi Gu Yi Liu Jian' to human tongue squamous cell carcinoma cell line Tca8113
MENG Bing-qi,WANG Min,CHENG Wei-dong. Basic Medical College, Lanzhou University, Lanzhou 730000,China
Objective vival days and increase the survival rate of patients with stomach cancer and hepatocarcinoma cancer，but its mechanism and effect to oral squamous cell carcinoma were still unclear.The purpose of this study was to explore the antitumor effect of serum containing prepared drugs from mouse treated by Chinese prescription'Qi Gu Yi Liu Jian'on human tongue cancer.Methods Human tongue squamous cell carcinoma cell line Tca8ll3 was used for in vitro studies.The effect of serum containing prepared drugs on oral squamous cell carcinoma was studied by using SRB cytotoxicity and clone formation asssay.Results The serum containing prepared drugs treated by QYJ inhibited the growth and survival to Tca8ll3 cell.Conclusion The direct antitumor effect of'Qi Gu Yi Liu Jian'is strong to human tongue squamous cell carcinoma cell line Tca8ll3.Its major mechanism might be direct toxicity to the oral squamous cell carcinoma.
[Key words] Qi Gu Yi Liu Jian; SRB cytotoxicity assay;clone formatin assay; squamous cell carcinoma
据统计资料分析，口腔颌面部恶性肿瘤占全身恶性肿瘤的8.2%，而舌部又是口腔癌的高发部位。口腔颌面部肿瘤的致病因素与发病条件至今被认为是一个较复杂的问题[1]。目前对口腔颌面部肿瘤病因的认识大多都接受“癌瘤病因综合作用”的概念，其中环境因素有化学、物理及生物等致病因素，机体内在的因素有免疫、激素、代谢及遗传等。近年的资料[2]表明，女性罹患舌癌者有上升的趋势，且女性患舌癌的预后相对比男性差，其真正发病因素尚待进一步研究。前瞻性研究表明，中药芪姑抑瘤煎能够延长肝癌、胃癌患者的生存期并提高生存率，但其抗肿瘤机制和对于口腔癌的疗效尚不十分明确。本实验采用芪姑抑瘤煎原方的基础上加射干，有上行、开窍之功效。笔者以人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞株为研究对象，探讨芪姑抑瘤煎对体外培养的人舌癌Tca8113细胞系细胞增殖的影响。
1 材料与方法
1.1 实验动物 昆明种小鼠，全雌性，18～22g，清洁级，由兰州大学动物实验中心提供并负责饲养。
1.2 主要试剂 SRB、胰蛋白酶系Sigma公司产品，用1%乙酸溶解成0.4%的溶液避光保存;RPMI1640为Sigma公司产品;小牛血清为四季青公司产品;各中药均购自黄河药市，由兰州大学药学院生药教研室鉴定。
1.3 细胞系 人舌癌细胞株Tca8113为兰州大学中西医结合研究所库存。以含10%小牛血清的RPMI1640培养液(100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素)，5%CO2，饱和湿度，37℃培养传代。
1.4 药物血清的制备 芪姑抑瘤煎(简称为QYJ)中红芪、党参、莪术、山慈姑、射干以2：1：1：2：1的比例加等量水煎煮，浓缩为10g生药/ml的药液，冷藏备用。取Balb/C小鼠77只，随机分成11组，每组7只小鼠。禁食12h后，分别灌胃给药，设8、16、32g/kg共3个剂量组，16、32g/kg设4个时间组，共9个药物组，正常对照组灌等量生理盐水，阳性对照组灌服复方天仙胶囊 (15g/kg)，给药剂量组给药2h后无菌采血，时间组给药后1、2、4、8h无菌采血。血样1000r/min，离心20min取血清，56℃ 30min灭活，置0～4℃冰箱备用。
1.5 细胞培养 将增殖良好处于对数生长期的细胞经0.25%胰酶及EDTA各半的消化液分散后计数，制成细胞悬液，接种于96孔板内，180μl每孔，预培养24h后，每孔加药物20μl(终浓度为配制浓度的1/10)，每孔总液量为200μl，每个药物浓度设6个复孔，并设空白对照(RPMI1640培养液和正常对照组不加药物，加等量生理盐水)，置于37℃，5%CO2，培养箱在全湿条件下培养48h。
1.6 SRB显色法 参照Skehan[3]的方法细胞培养结束后，取出培养板，每孔加入50%(质量体积)的三氯乙酸(TCA)50μl固定细胞，TCA的终浓度为10%，轻柔地加在每孔液面上，然后在4℃冰箱中放置1h，培养板各孔用去离子水洗涤5遍，以去除TCA。在空气中干燥后，每孔加0.4%的SRB100μl，室温下放置10～30min，弃去各孔内液体后用1%乙酸洗涤5遍，去除未结合的染料，空气中干燥后用pH为10.5，10mmol/L Tris(三羟甲基胺基甲烷)溶解，在平板振荡器上振荡5min，在酶联免疫检测仪测定OD值，用空白对照调零，所用波长为490nm。将所获肿瘤细胞生长抑制率定义为药物对肿瘤细胞的体外抑制率。
抑瘤率=无药细胞对照孔OD值-用药孔OD值 无药细胞对照孔OD值×100%
1.7 克隆形成试验 参照文献[4]的方法，将生长旺盛的Tca8113细胞用10%小牛血清的RPMI-1640培养液制成200个细胞/ml的细胞悬液，取4.5ml加入6孔板中，置于培养箱中预培养4h。加入药物血清0.5ml继续培养。10天后取出，倒置显微镜下计克隆数(50个细胞以上者为1克隆)，每组4皿，按均值，据公式(克隆形成率=克隆数/接种细胞数×100%)计算克隆形成率。
1.8 统计学分析 采用SPSS13.0统计软件分析，组间比较采用t检验。
2 结果
2.1 不同剂量药物血清对细胞生长的影响 QYJ处理小鼠2h的药物血清对Tca8113细胞与SRB的结合有显著的抑制作用。随着给药剂量的增加，药物血清的细胞增殖抑制作用增强，见表1。表1 QYJ处理小鼠2h的药物血清对Tca8113细胞SRB结合和克隆形成能力的影响 注：与空白对照组相比，aP<0.05，bP<0.01
2.2 不同时间药物血清对细胞生长的影响 观察16g/kg和32g/kg不同处理时间的小鼠药物血清对Tca8113细胞的影响，给药2～4h后的药物血清表现出更强的抑制作用，而8h血清对肿瘤细胞增殖无显著抑制作用，见表2。表2 QYJ不同处理时间的小鼠药物血清对Tca8113细胞SRB结合和克隆形成能力的影响注：与空白对照组相比，aP<0.05，bP<0.011
3 讨论
芪姑抑瘤煎原方为本校中西医结合研究所拟方，由红芪、党参、莪术、山慈菇组成。临床试用于治疗肝癌和胃癌，取得了较好的疗效，体外实验表明，其对人肝癌BEL-7402细胞和人胃癌SGC-7901细胞的增殖均有较强的抑制作用。本实验在原方的基础上加射干，用于治疗口腔癌，符合中医学辨证论治的特点。中药复方制剂所含化学成分较复杂，而且经过煎煮后各成分之间的相互关系难以确定。一方面要纯化各单体有许多困难，另一方面，这也失去了作为复方的意义。以整体动物灌胃给药，采集动物血清，处理培养的人肿瘤细胞，能较好地反映中草药特别是复方的药理作用机制。本研究证明芪姑抑瘤煎药物血清能显著抑制培养的人舌鳞癌Tca8113细胞生长;随着给药剂量的增加，抑制作用增强，给药2～4h后的药物血清表现出更强的抑制作用，而给药8h血清对肿瘤细胞增殖无显著抑制作用，可能与进入小鼠体内的有效成分代谢有关。芪姑抑瘤煎对肿瘤细胞的抑制作用，可能是其抗肿瘤的重要机制之一。
【参考文献】
1 Qiu WL.Theory and practice of oral and maxillofacial surgery.Beijing：People's Health Publishing House，2000,556-557
2 Liu BL，Gu XM. Oral and Maxillofacial surgery.Liaoning：Scientific and Technical Documents Publishing House,1999,280
3 Skehan P,Storeng R,Scudiero D,et al. New colorimetric cytotoxicity assay for anticancer-drug screening.J Nat Cancer Ins,1990,82(13):1107-1112.
4 王敏，贾正平，马骏，等.瑞香狼毒总黄酮提取物的抗肿瘤作用.中国中药杂志，2005，30(8)：603-606.