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【摘要】 目的 系统考察复方丹参方及其成分配伍的体外抗凝血作用，发现复方丹参方活血作用的物质基础，为体内动物实验提供参考依据。方法 以凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(KPTT)和凝血酶时间(TT)为检测指标，观察复方丹参方、丹参酮ⅡA、人参皂苷Rg1对这些指标的影响。结果 体外凝血研究的结果表明复方丹参方、丹参酮ⅡA、人参皂苷Rg1及其成分组合能延长凝血时间，且作用呈剂量依赖性。丹参酮ⅡA、人参皂苷Rg1起主要作用，丹参酮ⅡA、人参皂苷Rg1的成分配伍与复方丹参方的抗凝血作用没有明显差别。结论 丹参酮ⅡA、人参皂苷Rg1是复方丹参方活血作用的物质基础，两者配伍可以代替复方丹参方的抗凝血作用。
【关键词】 复方丹参方;丹参酮ⅡA;人参皂苷Rg1;凝血
Anticoagulation effects of Fufangdanshenfang and combination of active constituents
CAI Xia.Kangtai Hospital of Weifang, Weifang 261000, China
Objective To observe the blood anticoagulation effects of Fufangdanshenfang and understand the contributions of different constituents to activities of Fufangdanshenfang.Methods The action of Fufangdanshenfang and its constituents on prothrombin time (PT), activated partial thromboplastin time (APTT), thrombin time (TT) were determined.Results PT，APTT and TT were obviously prolonged in Fufangdanshenfang, TanshinoneⅡA, Ginsenoside Rg1 group, and these changes also observed in group of combined of TanshinoneⅡA and Ginsenoside Rg1.Conclusion TanshinoneⅡA and Ginsenoside Rg1 are active constituents of Fufangdanshenfang in the effect of anticoagulation.
[Key words] Fufangdanshenfang; tanshinoneⅡA; ginsenoside Rg1; anticoagulation
复方丹参方是临床最常用的治疗血瘀性冠心病的中药方，该方由丹参、三七和冰片三味中药组成，活血化瘀有效成分主要包括：丹参素、丹参酮ⅡA、人参皂甙Rg1等[1～3]。大量的药理学研究表明，复方丹参方具有抗心肌缺血、舒张血管、保护内皮损伤、缩小心肌梗死面积、抗自由基、减少缺血再灌注心肌损伤、保护心肌高能磷酸化合物及线粒体膜等广泛的心血管活性[4～10]。已有的研究基本明确了复方丹参的有效成分、药理作用、代谢产物及临床疗效。但是对于复方丹参方有效成分为基础最佳分子组合研究尚未系统开展。本文系统考察了复方丹参方及其成分配伍的体外抗凝血作用，发现了复方丹参方活血作用的物质基础，为体内动物实验提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物 Wistar大鼠，年龄6周，体重180～220g。
1.2 实验试剂及仪器 丹参酮ⅡA、人参皂苷Rg1购自中国生物制品研究所，凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(KPTT)和凝血酶时间(TT)检测试剂盒购自上海中生生物试剂公司。PABER-1型血小板聚集凝血因子分析仪，北京中勤世帝科学仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 复方丹参方的配置 称量丹参 450g、三七 141g、冰片 8g，先提取丹参，第一次加入乙醇回流1.5h，滤过，滤液回收乙醇，浓缩至相对密度为1.30 (55℃～60℃);第二次加入50%乙醇回流1.5h，滤过;第三次将三七细粉、冰片加入到丹参滤渣中，加5倍体积水回流2h， 滤过，合并第二、三次滤液，回收乙醇，浓缩至相对密度为1.40(55℃～60℃)。将制备的复方丹参方离心(12000g, 15min)，将上清用双蒸水调整浓度(相当原料药的浓度)为1kg/L，用0.22μm 的滤膜过滤除菌。放置在4℃冰箱储存。
1.3.2 富血小板血浆和贫血小板血浆样品的制备 用3%的戊巴比妥麻醉Wistar大鼠，在下腔静脉采血5ml(抽血前针管内混以3.8%枸橼酸钠0.5ml，取血时要注意防止气泡形成，以免影响血小板功能的测定)，然后离心(800rpm，10min)，得富血小板血浆(platelet rich plasma，PRP),将下层再离心(3000rpm，15min)，得贫血小板血浆(platelet poor plasma，PPP),用PPP测定凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(KPTT)和凝血酶时间(TT)。
1.3.3 PT的测定 取PT凝血活酶冻干品一只，加2.2ml蒸馏水，轻摇溶解;取贫血小板血浆0.1ml，药物1、2、4μl,37℃孵育2min后，加入37℃预温的凝血活酶0.1ml，混匀，记录凝固时间，即为凝血酶原时间(PT)。
1.3.4 KPTT的测定 取KPPT凝血活酶冻干品一只，加1.5ml蒸馏水，轻摇溶解;取KPPT凝血活酶悬液0.1ml，贫血小板血浆0.1ml，药物1、2、4μl,37℃孵育5min后，加入0.1ml 0.025mol/l的CaCl2溶液，混匀，记录凝固时间，即为活化部分凝血活酶时间(KPTT)。
1.3.5 TT的测定 取凝血酶冻干品一只，加5.0ml蒸馏水，轻摇溶解;取贫血小板血浆0.2ml，药物1、2、4μl,加入37 ℃预温的凝血酶0.1ml，混匀，记录凝固时间，即为凝血酶时间(TT)。
1.4 统计学处理 各组实验数据以均值±标准差(x±s)表示。两组间的差异显著性分析用t检验。
2 结果
2.1 丹参酮ⅡA对体外凝血的影响 丹参酮ⅡA能延长PT、KPTT、 TT，且随着药物浓度的升高凝血时间延长，说明作用呈剂量依赖性。结果见表1。表1 丹参酮ⅡA对体外凝血的影响注：与对照组比较bP<0.05;cP<0.01下同
2.2 人参皂苷Rg1对体外凝血的影响 人参皂苷Rg1能延长PT、 KPTT、 TT，且随着药物浓度的升高凝血时间延长，说明作用呈剂量依赖性。结果见表2。表2 人参皂苷Rg1对体外凝血的影响
2.3 复方丹参方对体外凝血的影响 复方丹参方能延长PT、 KPTT、 TT，且随着药物浓度的升高凝血时间延长，说明作用呈剂量依赖性。结果见表3。表3 人参皂苷Rg1对体外凝血的影响
2.4 复方丹参方成分组合对体外凝血的影响 复方丹参方中的丹参酮ⅡA和人参皂苷Rg1组合能延长PT、KPTT、 TT，且随着药物浓度的升高凝血时间延长，说明作用呈剂量依赖性。结果见表4。表4复方丹参方成分组合对体外凝血的影响
3 讨论
复方丹参方是治疗心血瘀阻型冠心病的常用中药方，以该方为基础开发的中成药如丹参滴丸，已被广泛应用于治疗冠心病等，临床疗效确切并且出口国外，产生了巨大的经济和社会效益。已有的研究基本明确了复方丹参的有效成分、药理作用、代谢产物及临床疗效。但是对于复方丹参方有效成分为基础最佳分子组合及信号分子组合研究尚未系统开展。复方丹参方及其成分配伍研究可以发现复方中的有效成分及各成分间的协同关系,从而实现复方的优化组合,实现由天然药物组方向化学成分组方的转化。
复方丹参方对肾上腺素血瘀模型大鼠血小板粘聚性升高有明显抑制作用[11]，对家兔血小板粘聚性升高也有明显抑制作用[12]。服用复方丹参滴丸后，治疗组的PT和APTT 水平较对照组显著升高，治疗组的纤维蛋白原(FIB) 水平较对照组显著下降[13]。复方丹参滴丸是多部位、多层面和多靶点抑制血小板的活化及聚集功能[14]。在被检血浆中加入标准化凝血酶溶液后其血浆凝固所需的时间为TT。在受检血浆中加入过量的组织凝血活酶和钙离子，使凝血酶原转变为凝血酶，凝血酶使纤维蛋白原转变为纤维蛋白而导致血浆凝固，其所需的时间被称为PT，PT是检测外源凝血途径有关因子的常用指标。以白陶土激活因子Ⅻ及Ⅺ，用脑磷脂代替血小板3因子(PF3)提供催化表面，加入钙离子后使贫血小板血浆凝固所需的时间称为APTT。若用白陶土作活化剂则称为KPTT，APTT是检测内源凝血途径因子异常较为敏感和常用的指标。复方丹参方、丹参酮ⅡA、人参皂苷Rg1、丹参酮ⅡA和人参皂苷Rg1组合能延长PT、 KPTT、 TT，且作用呈剂量依赖性。丹参酮ⅡA和人参皂苷Rg1的成分配伍与复方丹参方的抗凝血作用没有明显差别，两者配伍可以代替复方丹参方的抗凝血作用。
本文首次从成分和成分配伍角度系统考察了复方丹参方及其成分配伍的体外抗凝血作用，发现了复方丹参方活血作用的物质基础，为体内动物实验提供了参考依据。
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