鳖甲抗肝纤维化活性组分的研究

【摘要】  目的 筛选鳖甲抗肝纤维化的活性组分。方法 传代培养的HSC-T6与鳖甲Bj61～Bj68共同培养72h后，采用MTT比色法测定各浓度组HSC-T6的增殖情况。结果 Bj61～Bj65和Bj68对HSC-T6细胞无抑制作用，而Bj66和Bj67有较强的抑制作用。结论 Bj66和Bj67为鳖甲的活性组分。

【关键词】  鳖甲;活性组分;MTT比色法

　Studies on active constituent from Carapax Trionycis for anti-hepatic fibrosis

　　TANG Yin-ping, HU Chun-ling ,SHI Jing-ni,et al.Provincial and the Ministry of Education Key Laboratory of Resource Science and Chinese Herbal Compound in Chinese Medicine, Hubei College of Traditional Chinese Medicine，Wuhan 430061,China

　　 Objective To screen the active constituent from Carapax Trionycis. Methods Secondary culture HSC-T6 in vitro,which was co-cultrued with Bj61-Bj68 ,then MTT assay was applied to detect the impacts of Trionyx sinensis at different concentrations on HSC-T6. Results Bj61 - Bj65 and Bj68 had no inhibitory effect on HSC - T6 cells, but Bj66 and Bj67 had a stronger inhibitory effect on HSC - T6 cells. Conclusion Bj66 and Bj67 is the active constituent from Carapax Trionycis.

　　[Key words] Carapax Trionycis ;active constituent;MTT

　　鳖甲为鳖科动物鳖 Trionyx sinensis Wiegmann 的背甲，具有滋阴潜阳、软坚散结、退热除蒸的功效[1]。鳖甲常用于治疗慢性肝病、预防肝硬化[2～4], 是治疗肝纤维化疾患的常用中药，但鳖甲的活性成分鲜见报道。本实验依据活性筛选的思路, 在高建荣等[5]确定分子量小于6000的多肽为鳖甲抗肝纤维化活性部位的基础上，采用葡聚糖凝胶G-25、葡聚糖凝胶G-15进一步分离为8个组分，再用MTT比色法进一步筛选鳖甲抗肝纤维化的活性组分,为后续的筛选活性单体奠定了基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 对象 大鼠肝星状细胞系(HSC-T6)由浙江大学附属第一医院肝病研究所提供。

　　1.1.2 试验药物及主要试剂 (1)试验药物：鳖甲(醋制品)由浙江衢化医院提供，粉碎后过80目筛。(2)细胞培养试剂：胰蛋白酶(trypsin)、非必需氨基酸(NEAA)、 High-DMEM培养基，GIBCO产品 ;胎牛血清，武汉三利生物技术有限公司产品;青霉素、链霉素，华北制药股份公司产品;二氧化碳(CO2)，武汉市明辉气体科技有限公司。(3)细胞增殖用试剂：二甲基亚砜 (DMSO)、噻唑蓝 (MTT)，武汉凌飞科技有限公司。(4) 葡聚糖凝胶G-25、葡聚糖凝胶G-15:北京慧得易公司。

　　1.1.3 仪器 CO2培养箱，日本 SANYO公司产品;全自动酶标仪，美国 Bio-Rad公司产品;倒置相差显微镜，日本Olympus公司产品;洁净工作台，上海博迅医疗设备厂产品。

　　1.2 试验方法

　　1.2.1 鳖甲透析物干燥粉末的制备 精密称取鳖甲粉末100g，加200ml双蒸水超声提取20min，抽滤，残渣加水100ml超声10min，抽滤，合并滤液，冷冻干燥得冻干粉。再用少量水将冻干粉溶解，装于透析膜内，用100ml水于4℃透析5h，透析2次，合并膜外溶液，冷冻干燥。最后得鳖甲干燥粉末为淡黄色絮状粉末，即为鳖甲的抗肝纤维化活性肽类物质[5](M<6000)。

　　1.2.2 鳖甲抗肝纤维化活性部位不同组分的分离 称取50g葡聚糖凝胶G-25(Sephadex G-25)，加入过量双蒸水，加热溶胀约2h，放置冷却至室温，装柱。取0.3653g醋鳖甲透析物干燥粉末，用双蒸馏水8ml溶解，加入色谱柱上端，用蒸馏水洗脱，收集流分，每份10ml，共收集8个流分，即将鳖甲抗肝纤维化活性肽类物质分离为8个部位，分别记录为Bj1～Bj8，其中Bj4、Bj6和Bj7为活性部位[6]。再称取70g葡聚糖凝胶G-15(Sephadex G-15)，加入过量双蒸水，加热溶胀约2h，放置冷却至室温，装柱。取0.4012g Bj6样品，用双蒸馏水5ml溶解，加入色谱柱上端，用蒸馏水洗脱，收集流分，每份10ml，共收集8个流分，即将鳖甲抗肝纤维化活性部位Bj6分离为8个组分。提取分离流程见图1。

　　图1 提取分离流程1.2.3 HSC的培养及传代 将传代的HSC-T6培养于含10% 胎牛血清、100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素和1% NEAA的High-DMEM培养液中，置于37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养;在倒置显微镜下观察细胞长到亚单层或细胞密度约 80%～90%时，是HSC-T6传代的标志;吸弃培养基，加入0.25%胰蛋白酶1～2ml， 37℃ 消化2～3min，待细胞回缩，瓶壁有少量细胞脱落，即用含血清培养基终止;收集细胞悬液于50ml消毒离心管中，1700r/min， 4℃离心7min，弃去上清液，加入含 10%胎牛血清的DMEM用吸管反复吹打、分散细胞，取细胞悬液光镜下计数，完全培养基调整细胞浓度 ，以 1×105/ml传代。

　　1.2.4 MTT比色法测定 HSC增殖 传代 HSC-T6细胞按 1×105的密度接种于 96孔培养板，每孔加 100μl，细胞贴壁长满孔底12h后，换用 5%FCS的DMEM培养基，培养12h后，分别加入高、中、低剂量Bj61～Bj68 (以含 5%FCS的 DMEM 培养基倍比稀释成16、8、4mg/ml，用0.45μm滤膜过滤)，4孔重复，另设空白对照组(含5%FCS的DMEM培养基)。培养72h后，去培养基(翻板)，每孔加20μl MTT溶液。孵育4h，每孔加入 DMSO 100μl，在微型混合器上振荡 2min，10min后于酶标仪上0D490值，再按下式计算抑制率：抑制率=(1-药物组OD值 对照组OD值)×100%

　　1.3 统计学方法 实验结果以x±s表示。应用单因素方差分析，P<0.05表示差异有显著性。

　　2 试验结果

　　传代培养的大鼠肝星状细胞系HSC-T6与不同浓度Bj61～Bj68样品共同培养 72h后,采用 MTT比色法测定各浓度HSC-T6增殖情况。与空白对照组相比，样品Bj66、Bj67在各浓度对HSC-T6细胞均有抑制作用，其中高、中浓度差异均有显著性(P<0.05)。结果见表1。表1 鳖甲Bj61～Bj68对HSC-T6细胞增殖的抑制作用

　　3 讨论

　　肝纤维化是慢性肝病发展至肝硬化甚至原发性肝细胞癌的必经阶段，是各种慢性肝病的共同病理学基础[7]。在肝纤维化形成的过程中，肝星状细胞(HSC)的“持久化”激活和增殖是中心环节[8];阻抑激活的 HSC增殖和诱导促进 HSC凋亡是防治肝纤维化的重要措施[9]。在临床应用上，鳖甲为治疗肝纤维化的传统中药，但鳖甲含有蛋白质、多肽、氨基酸、多糖等物质，化学成分复杂，因而鳖甲的抗肝纤维化活性单体少见报道。本文在前期实验的基础上，采用葡聚糖凝胶G-15对鳖甲的活性部位Bj6进行分离，得到Bj61～Bj68共8个组分，再采用MTT比色法确定Bj66、Bj67具有明显抑制大鼠肝星状细胞系HSC-T6的增殖作用，即为鳖甲的抗肝纤维化活性组分;该活性组分的化学成分比Bj6少许多，就可以通过制备高效液相色谱分离得到单体，为下一步筛选活性单体打下坚实的基础。

【参考文献】
  　1 国家药典委员会.中国药典，一部.北京:化学工业出版社，2005，266.

　　2 姜宏伟. 单味鳖甲治疗肝炎肝硬化30例. 临床医学,2007，(6):93-94.

　　3 杨杰，谢春娇.鳖甲汤治疗乙肝肝硬化腹水38例.实用中医内科杂志，2005，19(4):362.

　　4 王英凯，王丹，唐彤宇.鳖甲为主的中药治疗肝纤维化的实验室和临床研究.临床肝胆病杂志，2002，18(4):253-254.

　　5 高建蓉，张赤志，邵志华，等.鳖甲对肝星状细胞增殖影响的研究.实用医学杂志，2007，23(11):16-18.

　　6 高建蓉，刘焱文，李昌煜，等.鳖甲抗肝纤维化活性物质的筛选与分离鉴定.中华肝脏病杂志，2010,18(5):341-347.

　　7 徐克成，江石湖.消化病现代治疗.上海：上海科技教育出版社，2001，486;493.

　　8 Friedman SL.Molecular regulation of hepatic fibrosis，an integrated cellular response to tissue injury.J Boil Chem，2000，275(4): 2247-2250.

　　9 Fredman SL， Lalazar A， Wong L， et al.HSC-T6 cells， an immortalized rat hepatic stellatecell line.Hepatology，1997，26(4Pt2):338A.