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【摘要】 目的 将人组织激肽释放酶（基因命名为KLK1，酶命名为hK1）cDNA克隆入大肠杆菌表达质粒，以重组菌表达的GST-hK1融合蛋白免疫小鼠，获得了分泌hK1特异单克隆抗体的杂交瘤细胞株。方法 将KLK1cDNA克隆入真核表达质粒，用获得的重组质粒转染COS-1细胞，经间接免疫荧光试验证明，上述单克隆抗体能与转染细胞发生特异反应。结果 经用方法证明，本研究研制的单克隆抗体还能与鸡输卵管表达的重组hK1发生特异反应。结论 这些试验结果表明，本研究制备的单克隆抗体能用于hK1的分子特性研究。
Preparation and identification of a monoclonal antibody specific
for humantissue kallikrein
Zhang Lei，Sun Huaichang，Wang Anping，et al.
Jiangsu Provincial Center of Animal Transgenesis and Biopharning，Yangzhou University，Yangzhou225009.
【Abstract】 Objective Establishment of a hybridoma cell line secreting a monoclonal antibody to facilitate iˉdentification of human tissue kallikrein（KLK1gene，hK1protein）.Methods Mice were immunized with E.coli-exˉpressed GST-hK1fusion protein and their spleen cells were fused with SP2/0myeloblastoma cells.Specificity of the monoclonal antibody was shown by Western blotting and by immunofluorescence.Results The monoclonal antibody reacted specifically to E.coli-expressed hK1and with the KLK1cDNA-transfected COS-1cells.In addition，the monoclonal antibody could recognize chicken oviduct-expressed hK1in a western blotting assay.Conclusion The monoclonal antibody is specific and useful for identification of hK1.
Key words human tissue kallirein monoclonal antibody identification
人组织激肽释放酶（EC3.4.21.35）是一种丝氨酸蛋白酶，为激肽释放酶-激肽系统的核心成员。hK1通过裂解激肽原的特异肽键而释放激肽，从而发挥一系列的生物学功能。早在1934年，Elliot R等 ［1］ 就报道了hK1与血压调节有关，这在以后的研究中得到进一步证实 ［2，3］。近年来的研究结果表明，hK1除具有降血压作用外，对肾脏损伤的修复也具有明显的治疗作用 ［4］ ，还可降低胶原密度、心肌细胞体积和左心室内径，并能增大毛细血管密度，从而有利于心脏重塑 ［5］ 。因此，hK1在心血管疾病治疗方面具有广阔的应用前景。
目前，临床上使用的组织激肽释放酶主要从猪的胰腺中提取，不仅来源有限，而且有病原污染危险。为了便于hK1基因工程产品的研制，本研究以大肠杆菌表达的GST-hK1融合蛋白为抗原免疫小鼠，利用常规的杂交瘤细胞技术获得了针对hK1的单克隆抗体，并对其进行了初步鉴定，为重组hK1的分离和鉴定打下了基础。
1 材料与方法
1.1 主要试剂 原核表达重组质粒pGEX-KLK1 ［6］ 、真核表达重组质粒pcDNA-KLK1 ［7］ 和鸡输卵管特异表达重组载体pOVKLK1 ［8］ 由本室构建;DMEM基础培养基、次黄嘌呤（H）、胸腺嘧啶（T）、氨基喋啶（A）为GIBCO公司产品;25kDa聚乙烯亚胺（polyethyleneimine，PEI）、弗氏佐剂和聚乙二醇资助（PEG，分子量1450）购自Sigma公司;GSH和GSSG购自上海伯奥生物公司;猪源性K1标准品购自上海生化试剂公司;鸡输卵管表达的重组hK1由本室制备;犊牛血清购于杭州四季清生物公司;二氨基联苯二胺（DAB）为华美生物公司的产品;其余试剂均为国产分析纯级。
1.2 细胞系和实验动物 SP2/0骨髓瘤细胞系由扬州大学畜牧兽医学院微生物教研室提供;COS-1细胞购自中科院上海细胞生物学研究所;ICR母鼠和8周龄BALB/c母鼠由扬州大学实验动物中心提供。
1.3 免疫原的制备 GST-hK1融合蛋白在大肠杆菌中的表达及不溶性包涵体的制备按发表的方法进行 ［9］ 。将IPTG诱导和离心沉淀后的重组菌重悬于PBS中，于冰浴中用超声波裂解菌体，经12000rpm4℃离心10min后，将沉淀（主要为不溶性包涵体）悬浮于洗涤缓冲液（50mMTris-C1，50mA NaCl，1mM EDTA，0.1%Triton x100，100mMβ-ME，2M尿素，pH8.0）中，12000rpm4℃离心10min，收集沉淀，如此反复洗涤3次。然后将沉淀在20mMTris-C1（pH8.0）中离心洗涤1次。向沉淀悬液中加入8M尿素，振荡混匀和沉淀溶解后加入预冷的复性液（50mM Tris-C1，1mM EDTA，1mM GSSG，1mM GSH，pH8.0），使尿素的终浓度为0.1M，4℃复性12h，取10μl样品进行SDS-PAGE电泳分析。
1.4 小鼠的免疫 按标准方法 ［10］ 进行。将50μg复性蛋白与等体积的弗氏完全佐剂混合乳化后，腹部皮下多点注射每只小鼠，以后每隔2周注射1次与弗氏不完全佐剂混合的同量抗原，共注射4次。融合前采集血样，并用ELISA检测抗体效价 ［11］ 。
1.5 细胞融合及克隆化 免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞的融合按常规方法 ［10］ 进行。融合细胞在含氨基喋啶的选择培养液中培养至出现肉眼可见的克隆后，先以GST-hK1融合蛋白为抗原，分别用间接ELISA和Dot-ELISA筛选阳性克隆，然后再以亲和层析纯化的GST为抗原，筛除针对GST的阳性克隆，剩下的即为针对hK1的阳性克隆。阳性克隆经过2次亚克隆后，获得1株稳定分泌hK1特异抗体的单克隆杂交瘤细胞株。腹水单抗的制备按常规方法 ［10］ 进行。
1.6 单克隆抗体的效价测定 以Glutathine Sepharose4B层析柱纯化的GST-hK1融合蛋白为抗原，分别用间接ELISA和Dot-ELISA对荷瘤小鼠腹水中的抗体效价进行测定。
1.7 单克隆抗体的鉴定 分别以Glutathine Sepharose4B层析柱纯化的GST-hK1融合蛋白、猪源性K1和含重组hK1的蛋清为材料进行蛋白质印迹杂交 ［12］ 。第一抗体为100倍稀释的腹水单抗，第二抗体为HRP-标记的羊抗鼠IgG。将5×10 4 个/孔（70%密度）COS-1细胞接种于24孔细胞培养板，在含10%FCS的MEM中培养24h后，按发表的方法 ［13］ 进行基因转染。转染质粒为2μg pcDNA-KLK1，脂质体为10mM25kDa PEI，转染时间为3h。基因转染48h后，用预冷的PBS洗涤细胞3次，用预冷的丙酮/乙醇（3∶2）固定液固定3min后进行间接免疫荧光反应 ［11］ ，第一抗体为500倍稀释的腹水单抗，第二抗体为FITC标记的兔抗鼠IgG。
2 结果
2.1 杂交瘤细胞株的建立 经4次免疫后，小鼠血清ELISA抗体效价高达1∶8000以上。融合细胞培养上清经DOT-ELISA和ELISA检测，共获得6个针对hK1的阳性克隆。对其中的1个克隆进行2次亚克隆和进一步鉴定，获得1株稳定分泌hK1特异抗体的杂交瘤细胞株，命名为SP-KLK1。
2.2 单克隆抗体的效价 将10 5 个上述杂交瘤细胞注射入经降植烷处理的BALB/c小鼠的腹腔，9天后采集腹水。以亲和层析纯化的可溶性GST-hK1融合蛋白为抗原，经间接ELISA和Dot-ELISA检测证明，腹水中的抗体效价高达1∶8000以上。
2.3 单克隆抗体的特异性 为了证明杂交瘤细胞株分泌的是针对hK1的特异抗体，分别以IPTG诱导的pGEX-KLK1转化菌、IPTG诱导的pGEX-6p-1转化菌和未诱导的pGEX-KLK1转化菌裂解物为抗原，进行Western blotting分析，结果仅在IPTG诱导的pGEX-KLK1转化菌裂解物中检测到预计分子量（约48kDa）的特异条带（图1）。
2.4 单克隆抗体的应用 为了检验获得的单克隆抗体能否用于重组hK1的鉴定，用表达人KLK1cDNA的重组质粒pcDNA-KLK1转染COS-1细胞，然后以杂交瘤细胞株制备的腹水单抗为第一抗体，以兔抗鼠IgG荧光标记抗体为第二抗体，对转染细胞进行免疫荧光试验，结果仅pcDNA-KLK1转染细胞出现特异的绿色荧光，而在未转染细胞中无特异荧光（图2）。
为了进一步验证上述单克隆抗体能否用于重组hK1的鉴定，分别以正常鸡蛋清、大肠杆菌表达的GST-hK1融合蛋白、猪源性K1和含重组hK1蛋清为抗体，以获得的单克隆抗体进行Western blotting分析，结果正常蛋清未出现条 带，GST-hK1融合蛋白为一条约48kDa的特异条带，与猪K1呈阴性反应，在含重组hK1的鸡蛋清中出现两条带（图3），约30kDa条带可能是成熟的rhK1，而33kDa条带可能是rhK1酶原。
图1 重组菌裂解物的Westernblotting分析
1.低分子量蛋白质markers;2.TPTG诱导的pGEX-KLK1转化菌;3.IPTG诱导的pGEX-6p-1转化菌;4.未诱导的pGEX-K