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【摘要】 目的 探讨丹参对硬皮病成纤维细胞基质金属蛋白酶1（又被称为间质胶原酶1）的生成和mRNA表达的影响。方法 采用酶联免疫吸附实验（ELISA）和Northern杂交技术检测了培养硬皮病成纤维细胞基质金属蛋白酶1蛋白的合成分泌和mRNA的表达。结果 培养硬皮病成纤维细胞基质金属蛋白酶1蛋白的自发分泌量为149.021±23.70pg/ml，加入1mg/ml和5mg/ml含丹参培养基后，基质金属蛋白酶的浓度分别为182.27±33.57pg/ml（P<0.05）和207.78±27.85pg/ml（P<0.01）。加入丹参5mg/ml后，培养硬皮病成纤维细胞的基础基质金属蛋白酶1mRNA的表达被提高到156%±18%（P<0.05）。结论 丹参提高培养硬皮病成纤维细胞基质金属蛋白酶1蛋白的合成分泌及其mRNA的表达，这可能是丹参发挥抗硬皮病纤维化作用的又一新机制。
The effects of Salvia miltiorrhiza on the production of matrix metalloprot
einase1in culturing scleroderma fibroblasts Tang Peiyun，Zheng Xueyi
The First People’s Hospital of Guangzhou，Guangdong510180.
【Abstract】 Objective To investigate the effects of Salvia miltiorrhiza on the protein production and mRNA expression of matrix metalloproteinase1（interstitial collagenase1）in culturing fibroblasts of patients with scleroderˉma.Methods Production and secretion of matrix metalloproteinase1protein was measured by enzyme-linked imˉmunosorbent assay（ELISA）.Using Northern hybridization，the expression of matrix metalloproteinase1mRNA was also determined.Results The level of matrix metalloproteinase1protein was149.021±23.70pg/ml secreted autoˉmatically by scleroderma fibroblasts without stimulation.After reatment with Salvia miltiorrhiza at concentration of1mg/ml and5mg/ml，and the levels of matrix metalloproteinase1protein were182.27±33.57pg/ml（P<0.05）and207.78±27.85pg/ml（P<0.01）respectively.Northern hybridization detection found that the amount of matrix metˉalloproteinase1was increased to156%±18%（P<0.05）by scleroderma fibroblaststreated with Salvia miltiorrhiza（5mg/ml）.Conclusion Salvia miltiorrhiza up-regulated the production and secretion of matrix metalloproteinase1protein and itsmRNA expression in culturing scleroderma fibroblasts，indicating that this might be a new mechanism through which Salvia miltiorrhiza exerted anti-fibrosis effects.
Key words Salvia miltiorrhiza scleroderma fibroblasts matrix metalloproteina
se1 丹参（Salvia miltiorrhiza Bge）是一种常用抗纤维化中药，其主要成分为多种呋喃屏菲醌类化合物，如:丹参酮，丹参酚，异丹参酮，丹参新酮等。丹参常常被用作抗纤维化复方的君药，单味丹参的应用亦很广泛。丹参被用于纤维化硬化相关的疾病，如:心脑血管硬化，肝硬化，硬皮病等疾病 ［1］ 。关于丹参防治肝纤维化的作用已屡有实验和临床报道 ［2］ 。已证实，丹参还可抑制皮肤成纤维细胞的合成 ［3，4］ 。王爱民等人研究还发现丹参可提高肝脏成纤维细胞酶原酶的合成分泌 ［2］ 。但关于丹参是否能够调控硬皮病成纤维细胞，目前尚未见报道。因此，本研究检测了丹参对培养硬皮病成纤维细胞基质蛋白酶1（matrix metalloproteinase1），又称间质胶原酶1（interstitial collagenase1）调控。通过酶联免疫吸附实验和Northern杂交检测发现:丹参既可提高培养硬皮病成纤维细胞基质金属蛋白酶1蛋白的合成分泌，又可提高培养硬皮病成纤维细胞基质金属蛋白酶1mRNA的表达。现报告如下。
1 材料和方法
1.1 研究对象 诊断符合美国风湿病协会标准的5例硬皮病患者进入本实验。用于成纤维细胞培养的组织为病理活检标本的一部分。实验采用自身对照，皮肤成纤维细胞培养采用组织块法，以DMEM培养基进行培养，四代或五代细胞用于实验。本研究所用培养基中丹参的浓度是根据丹参注射液（上海第一制药厂提供，2ml/支，1.5g/ml）临床用量折合的丹参生药量，再根据其含有丹酚酸B的含量，估算上述成分进入人体时细胞外液含量而确定，并参考了张国强等人报道的浓度 ［5］ 。
1.2 丹参处理培养成纤维细胞的方法 将细胞稀释至5×10 4 /ml，培养于适当培养皿中24h后换培养基一次，此时加入含一定浓度丹参的培养基，再培养48h，收集上清液和mRNA，用于基质金属蛋白酶1蛋白的合成分泌和mRNA表达的检测。
1.3 酶联免疫吸附实验（ELISA） ［6］ 酶联免疫吸附实验（夹心法）试剂盒购自Oncogene公司，操作参照试剂盒说明。简言之，样本被加入预先吸附有鼠抗人基质金属蛋白酶1抗体（Ⅰ抗）的96孔板中，室温孵育2h。经充分清洗，再加入兔抗人基质金属蛋白酶1抗体（Ⅱ抗），再孵育清洗，加入标有辣根过氧化物酶的Ⅲ抗，经孵育，清洗，加入反应底物（含四甲基联苯胺），反应30min，用酶标仪选450nm和570nm读取OD值，计算基质金属蛋白酶1浓度。每一标本同时检测两次。最后标本的基质金属蛋白酶1浓度再以每10 6 个细胞进行校正。将成纤维细胞调整细胞浓度为10 4 /L，接种于直径为3cm培养皿，24h后换入含丹参的培养基，丹参的浓度为1mg/ml和5mg/ml。再培养48h后，收集上清液，用于基质金属蛋白酶1的检测。收集上清液后，再将培养皿中成纤维细胞收集计数。所得细胞数用于校正上清液中基质金属蛋白酶1的浓度。
1.4 Northern杂交 ［5］ 总RNA的提取采用Trizol裂解液（含38%酚，2M异硫氰酸胍和0.4M异硫氰酸胺）进行提取。每个泳道加入总RNA量为10μg。将RNA与适当浓度的MOPS、甲醛、甲酰胺混合后，65℃变性。再经速冷后采用1.5%甲醛变性凝胶电泳分离。随后将RNA转移到尼龙膜，固定后，采用高SDS杂交液预杂交和杂交。杂交时间为24h，温度为56℃，探针为DIG-dUTP标记cDNA探针。cDˉNA-mRNA杂交带的显色使用罗氏公司（德国）地高辛显色试剂盒。基质金属蛋白酶1杂交带经密度扫描定量，再以β-actin mRNA的量进行矫正，以消除加样不均。最后将对照组折算为1与实验组比较。cDNA探针的合成和标记:采用Micro-Fast Track TM 2.0试剂盒（Invitrogen公司，美国）提取人poly A + mRNA;采用cDNA CYCLE TM 试剂盒（Invitrogen公司，美国）合成cDNA.PCR地高辛标记反应体系含有合适浓度的cDNA、引物（20～50pmol）、MgCl 2 dNTP、DIG-dUTP（罗氏公司，德国），Taq多聚酶（TaKaRa公司，日本）。PCR反应条件为95℃变性，57℃复性，72℃延伸，共40个循环。基质金属蛋白酶1引物序列:sense:5’AAC TGC CAA ATG GGC TTG AA3’anti-sense:5’CCC TTT GAA AAA CCG GAC TTC3’。3β-actin引物序列:sense;5’GAC TAT GAC TTA GTT GCG TTA3’，β-actin antisense:5’GCC TTC ATA CAT CTC AAG TTG3’。
2 结果
2.1 丹参对培养硬皮病成纤维细胞基质金属蛋白酶1蛋白合成分泌的影响 将每一患者培养成纤维细胞中的3皿（3cm直径培养皿）培养细胞用于基质金属蛋白酶1蛋白合成分泌检测。每个上清液同时用ELISA检测2次，每个患者ELISA实验被重复3次。未加入丹参对照组成纤维细胞上清液中基质金属蛋白酶1的浓度为149.02±23.70pg/ml。加入1mg/ml和5mg/ml含丹参培养基后，基质金属蛋白酶的浓度分别为182.27±33.57pg/ml和207.78±27.85pg/ml。经配对t检验，1mg/ml组与对照组之间（t=2.905，P<0.05）;5mg/ml组与对照组之间（t=5.133，P<0.01），即:加入丹参的任何一组与未加入丹参的对照组均有显著差异。经Spearman相关性检测分析或其它相关性分析，未能发现基质金属蛋白酶1浓度的升高和丹参的浓度呈正相关（n=5，r=0.984，P>0.05）。
2.2 丹参对培养硬皮病成纤维细胞基质金属蛋白酶1mRˉ NA表达的影响 将每一患者的培养成纤维细胞中的3-5皿（10cm直径培养皿）培养细胞用于Northern杂交实验。实验重复3次以上。在Northern杂交实验中，丹参在培养基中的浓度为5mg/ml。最典型结果示于图1。可见任何一位患者的基质金属蛋白酶1mRNA的表达都被提高，增高率大约在20%～40%之间。经密度扫描和相对定量分析，结果见图2，图中所示为基质金属蛋白酶1mRNA的相对含量。可见基质金属蛋白酶1mRNA的表达被显著增高，经统计学分析差异有显著性（t=6.786，P<0.01）。
3 讨论
基质金属蛋白酶1是金属蛋白酶家族的成员之一，又被称为间质胶原酶 ［6，7］。其主要功能是修饰再塑和/或降解细胞基质和胶原，如:胶原Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ等。另外，它还参与细胞因子和趋化因子的降解，使细胞因子趋化因子裂解，形成无活性的拮抗成分。因此基质金属蛋白酶1即参与纤维化的发生形成，又参与细胞因子相关的免疫炎症 ［6，7］ 。硬皮病的发病是自身免疫紊乱而引起的异常纤维化硬化。纤维化硬化可发生于皮肤和任何内脏器官。纤维化硬化的形成主要是由于细胞外基质胶原等成分合成的增强，同时有细胞外基质胶原等成分修饰再塑和降解的异常所致。目前尚未见到关于丹参是否调控培养硬皮病成纤维细胞基质金属蛋白酶1合成的相关报道。本研究从蛋白合成分泌和mRNA表达两方面检测了丹参对培养硬皮病成纤维细胞基质金属蛋白酶1合成的调控，发现丹参既可提高培养硬皮病成纤维细胞基质金属蛋白酶1蛋白的合成分泌，又可提高培养硬皮病成纤维细胞基质金属蛋白酶1mRNA的表达。王爱民等人已报道丹参可提高肝脏成纤维细胞基质金属蛋白酶1的合成 ［2］ 。本研究结果与他们的结果是一致的。本研究结果提示丹参可调控培养硬皮病成纤维细胞基质金属蛋白酶1mRNA的合成，并且丹参的调控作用发生在mRNA转录之前。丹参用于硬皮病的治疗在临床上已取得了肯定的疗效。张玄 ［3］ 和王