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【摘要】 目的 在同种异体脱细胞基质中植入幼儿包皮成纤维细胞，构建人工真皮替代物，以研究细胞的生长、分化、增生及真表皮间的相互作用，为研制大面积创面覆盖物———复合皮奠定基础。方法 （1）酶消化法培养幼儿成纤维细胞;（2）制备尸体皮脱细胞基质，接种成纤维细胞后于不同时间观察细胞的形态变化;（3）细胞计数;（4）H.E染色;（5）扫描电镜观测脱细胞基质的表面是否有成纤维细胞附着;（6）三联染色观察人工真皮中胶原纤维、弹力纤维及网状纤维的分布。结果 （1）利用脱细胞基质构建的人工真皮形成后质地与颜色近似真皮组织，有一定的弹性，可出现较明显的细胞增殖，未见人工真皮收缩现象。（2）细胞计数法所得生长曲线表明植入尸体皮脱细胞基质中的细胞具有典型的细胞增殖现象。（3）H.E染色可见成纤维细胞主要分布于脱细胞基质表面。（4）扫描电镜下可见脱细胞基质表面有梭形的成纤维细胞出现，且成纤维细胞紧密贴附于脱细胞基质上。（5）三联染色显示人工真皮中存在胶原纤维及成纤维细胞新合成的弹力纤维。结论 成纤维细胞在脱细胞基质中有着活跃的生物学特性，以脱细胞基质为支架构建的人工真皮具有同正常真皮相似的结构与功能。
Study on how to make the artificial dermis
by homo-acellular dermis matrix
Liu Jie，Wang Dewen，Zhang Yan，et al.
Institute of Radiation Medicine，Academy
of Military Medical Sciences，Beijing100850.
【Abstract】 Objective To transplant the fibroblast as the seeding cell intothe acellular dermis matrix（ADM）in order to investigate the growth，differentiation，increasing and the function between the epidermis and the dermis，siˉmultaneously，prepare for making the artificial composite skin.Methods （1）Trypsin was used as the isolation mediˉum to get the fibroblast;（2）Prepare for cadaver skin acellular dermis matrix，the change of cell configuration was obˉserved;（3）Counting the cell number;（4）H.E staining;（5）Whether the cells attaching into the matrix was observed by scanning electron microscope（SEM）;（6）Triad staining was used to observe the distribution of collagen fibers，elasˉtic fibers and argyrophilic fiber.Results （1）The character and color of the artificial dermis were similar to the normal dermis，the artificial dermis was not fragile，proliferation of the cells could be clearly observed，and contraction of thedermis was not observed.（2）The growth curve showed that the cells in the collagen membrane proliferated after it was transplanted into the trestle.（3）The collagen membrane was pale red color by H.E staining，the fibroblatsts were foundon the surface of the matrix.（4）There were fusiform cells on the surface of the matrix by SEM，and the cells tightly attach into the dermis.（5）The fibroblasts in the membrane had active biologic function，triad staining showed that there were collagen fibers and elastic fibers after the fibroblasts were transplanted into the trestle.Conclusion The cultured fibroblasts in the ADM had active biologic character，the dermis made by this trestle possessed similar structure and function to the normal skin.
Key words fibroblast acellular dermis matrix tissue engineering of skin
除去细胞成分的脱细胞基质，由于通过酶消化、高渗盐浸泡等去除异体（种）皮中的表皮层和真皮细胞成分，而保留正常的胶原三维结构及基底膜，因此抗原性降低，且能迅速被血管化及对胶原酶不敏感，抗感染能力强，因此受到皮肤组织工程工作者的重视。美国德克萨斯LifeCell公司生产的经过特殊程序处理的无细胞同种异体人真皮基质AllˉDoerm已经推向市场，并可支持宽而薄的网状自体皮覆盖，其效果相当于厚的自体皮移植。已在Ⅲ°和深Ⅱ°烧伤中起到永久性真皮替代物的作用。但由于单纯的脱细胞基质缺乏活的成纤维细胞，需靠逐渐长入的成纤维细胞分解基质，将延缓真皮重建，因此，利用本实验室已研制成功的尸体皮脱细胞基质，构建了人工真皮，为建立一种新的人工真皮及构建具有表皮结构的人工复合皮提供了一种新的途径。
1 材料和方法
1.1 材料 DMEM培养基、胰蛋白酶、胶原酶、小牛血清均购自Gibico公司，尸体皮脱细胞基质由本实验室制备。
1.2 胎儿成纤维细胞的培养 采用本实验室建立酶消化法培养 ［1］ ，并进行传代和鉴定，取其3～4代细胞制备细胞悬液。
1.3 人工真皮的构建 60 Coγ射线消毒脱细胞基质，用双抗（青霉素1×10 5 U/L、链霉素100mg/L）D-Hanks液彻底冲洗后，加入DMEM培养液浸泡24h，将传代培养的成纤维细胞以3×10 5 /cm 2 密度接种于脱细胞基质上（3×10 8 /L，每孔接种1ml，脱细胞基质切成1cm2 大小的正方形），37℃，5%CO 2 条件下培养。
1.4 细胞生长曲线的绘制 接种后2周内，每天采用0.25%胶原酶消化下脱细胞基质上的细胞，进行细胞计数，并绘制细胞生长曲线。
1.5 H.E染色 培养1～3周，用中性福尔马林液固定，常规组织切片，H.E染色，镜下观察。
1.6 SEM观察 培养1天、3天、1周、2周、3周，采用SEM观察成纤维细胞在脱细胞基质表面的生长状况。具体步骤同人工胶原膜观察孔径的方法。
1.7 三联染色法 第2周时，将人工真皮置于中性福尔马林固定，按参考文献 ［2］ 方法进行染色。
2 结果
2.1 倒置显微镜下，由于脱细胞基质透光能力较弱，因此，难以明确观察到脱细胞基质表面细胞形态和数量的变化。但在种植成纤维细胞后8h，即可见到平皿底部有部分成纤维细胞附着。
2.2 细胞计数法结果 结果显示:附着在脱细胞基质上的细胞在刚刚种植的2天细胞数量无明显变化，而且只有种植细胞数量的1/3左右，但从第3天开始，细胞增殖明显，以后逐渐增加，到第10天，细胞增殖进入平台期，第11天～第14天，细胞数量基本无变化。（如图1所示）。图1 脱细胞基质表面成纤维细胞增殖情况
2.3 H.E染色显示 第1周时，细胞附着在脱细胞基质的表面，部分地方连接成片，但未见到成纤维细胞向基质内部生长;第2周时，在基质表面形成一连续的细胞层，且有少量细胞长入脱细胞基质内;第3周时，基质表面连续细胞层依然存在，长入基质内部的细胞增多（如图2所示）。
2.4 SEM结果显示 第1天在基质表面可见到成纤维细胞附着，有的细胞仍然是圆形，有的细胞则已伸出小的突起，大多数细胞有2～3个突起。第3天成纤维细胞增多，大多数细胞呈长梭形，紧密贴附于基质表面。随着培养时间延长，基质表面细胞逐渐增多，至第2周时，于脱细胞基质的表面基本上长满成纤维细胞（如图3所示）。
2.5 三联染色结果表明 未种植成纤维细胞的脱细胞基质，仅可见到红色的胶原纤维，而构建好的人工真皮，共培养2周后，在脱细胞基质表面和内部，除红色的胶原纤维外，还有蓝绿色的弹性纤维存在。但未见到呈黑色的网状 纤维。
图2 利用脱细胞基质构建的人工真皮第2周基质表面形成一连续的细胞层（H.E×400）
图3 利用脱细胞基质构建的人工真皮第2周脱细胞基质的表面基本长满成纤维细胞（SEM×250）
3 讨论
尸体皮脱细胞基质是较早在美国实现商品化（Alloˉderm）并应用于临床的皮肤替代物之一 ［3～5］ ，但由于它固有的某些缺点，如:缺乏细胞成分、需要与自体皮联合移植，使它的使用受到了限制 ［6～9］ 。受另外一种商品化皮肤覆盖物（Apligraf）采用新生儿细胞作为种子细胞进行同种异体皮移植，而且在临床应用中，极少发生免疫排斥反应的启发 ［10］ ，我们采用胎儿成纤维细胞作为种子细胞，构建了人工真皮。经细胞计数、H.E染色及SEM观察均显示，此尸体皮脱细胞基质与胎儿成纤维细胞结合状态良好，并且随着培养时间的延长，细胞数量逐渐增多，虽然在刚刚种植于脱细胞基质上时，有一部分细胞未能粘附而脱落到培养皿中，但可以采用更换培养皿，将培养皿中的细胞消化下来重新利用，或增大脱细胞基质的面积，从而使更多的细胞与基质表面接触并粘附的方法，提高细胞的数量，加以改进，在后面的实验中采用了增大接触面积的方法，细胞粘附率有所提高。由于成纤维细胞的存在，在临床应用中，既可增加基质与创面的粘附，促进真皮基质的重建，又可有效调节覆盖于其上的自体皮的生长，促进创面的早期愈合 ［11～13］ ，因此种植有胎儿成纤维细胞的脱细胞基质较单纯的脱细胞基质，具备更大的应用潜力。细胞的生长曲线显示，在第10天左右，细胞在基质表面即可覆盖长满，因此，在未来的临床应用中，可在此时即覆盖创面，再植以自体皮，这也为临床应用节省了时间，同时，也可利用这一支架构建人工复合皮，实现与正常皮肤结构和功能更加近似的人工皮肤的体外重建。
参考文献
1 刘杰，崔雪梅，张燕，等.利用不同支架材料构建人工真皮的研究.中国修复重建外科杂志，2003，17（2）:104-107.
2 龚志锦，詹洲.病理组织制片和染色技术，上海:上海科学技术出版社，1994，65-66.
3 姜笃银，陈壁，贾赤宇.戊二醛交联的异种/异体脱细胞真皮基质的制作及临床应用观察.第四军医大学学报，1999，20（5）:371-374.
4 Schultz O，Keyszer G，Zacher J，et al.Development of in vitro model sysˉtems for destructive joint disease:novel strategies to establish inflammaˉtory pannus.Arithritis Rheum，1997，4