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【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-077X（2004）08-0673-03
Comparing the effect of tripterygiitotorum（T II ）and FK506 ophthalmic solutions on the corneal allograft rejection
Deng Hongwei，Li Chen，Chen Jiansu，et al.
Shenzhen Ophthalmic Center of Jinan University Medical College，Shenzhen518001.
【Abstract】 Objective To observe and compare the effect of the T II ，FK506，ophthalmic solutions on the corneal allograft rejection.Methods The corneal transplantation model on the closed colony rats were set up and then were randomly divided into A，B and C groups by the using of different eye-drops.Graft fate was assessed clinically by slit-lamp biomicroscope examination，included the corneal clarity，edema and vascularization，and the rejection time.Other histolog
ical and immunohistochemistry assessments were done at definite intervals after grafting.Results There were no statistical different between group0.03%T II and0.05%FK506in prolonging the corneal survival.While comparing the histopathological and immunohistochemistry findings between the groups，the results confirmed that the topical application of T II and FK506eye-drops could significantly reduce the inflammatory cells infiltrating of the graft stroma and the neovasculari
zation，whilst reduce the production of ICAM-1and IL-2.Conclusion The corneal allograft rejection could be significantly suppressed by the local use of T II ophthalmic solution.0.03%T II has the same effect as the0.05%FK506in prolonging the corneal survival.
Key words tripterygiitotorum（T II ） keratoplasty graft rejection
角膜移植免疫排斥反应是角膜移植失败的主要原因。寻找高效低毒的免疫抑制剂一直是临床面临的主要问题。目前预防和治疗角膜移植排斥反应的药物有皮质类固醇、环孢霉素A及FK506。FK506（Tarolimus）是一种与环孢霉素A作用机制类似的药物，是通过抑制混合淋巴细胞反应和细胞毒性T细胞来发挥免疫抑制作用，据报道其免疫抑制强度是环孢霉素A的10～100倍 ［1］ 。虽然目前已经研制出FK506局部应用的制剂，但由于其价格昂贵，尚未能在临床上普遍应用。雷公藤（tripterygium wilfordii Hook.f.，TWHf）有免疫抑制、抗炎、抗生育、抗肿瘤和抗菌作用。雷公藤多苷（tripterygiitotorum，T II ）是其中多种成分（二萜内酯、生物碱、三萜等）的组合，既保留了雷公藤生药的免疫抑制作用，又去除了许多毒性成分 ［2］ 。全身应用雷公藤多苷片已证明可用于治疗实验性葡萄膜炎 ［3］ ，抑制实验性角膜移植排斥反应 ［4］ ，并在临床上已用于治疗眼部的多种免疫性疾病以及炎症性疾病，如:巩膜炎 ［5］ 、蚕食性角膜溃疡等免疫性角膜病、白内障术后的炎症反应 ［6］ 、春季卡他性结膜炎、青睫综合征等其他免疫性眼病 ［7］ 。上述治疗虽疗效显著，但仍出现胃肠不适和可逆性抑制精子活性等副作用。
为避免雷公藤制剂全身应用所带来的毒副作用，本研究研制出T II 滴眼液，并将其应用于大鼠角膜移植排斥模型。观察并比较雷公藤滴眼液与0.05%FK506对角膜移植免疫排斥反应的抑制作用。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 雌性SD（Sprague-Dawley）大鼠30只，重量（180±10）g。Wistar大鼠9只，雌性，重量（200±10）g。均由中山医科大学动物中心提供（普通级，广东省科委实验动物监测所合格证号:00A005）。
1.1.2 T II 滴眼液研制 取相应计量T II 粉（由三九制药厂提供）配制成300μg/ml质量浓度的T II 滴眼液以及空白对照（仅含滴眼液基质成分，即含有2%DMSO和90%人工泪液）滴眼液，将所有滴眼液调pH值于6～7之间，采用加热灭菌方式制药，全过程在暨南大学一附院中药制剂室完成。
1.1.3 0.05%FK506滴眼液 购于中山眼科中心（批号:20010201）。
1.1.4 兔抗大鼠单克隆抗体 抗CD 25 、抗CD 54 + （均由DAˉCON提供），二抗:羊抗兔血清，过氧化酶标记的免疫组化二步法试剂盒［DAKO EnVision TM 试剂盒（兔/鼠双标）］。
1.1.5 AB（Dianinoben-zidine tetrahydrochloride）染色液 溶解4～6mg DAB于0.05mol/L pH7.6的10ml Tris缓冲液中，充分溶解后过滤。避光保存，用前加入30%H 2 O 2 3ml。DAB:3，3’-二氨基联苯胺（呈棕色），为过氧化酶的供体氢。
1.2 方法
1.2.1 大鼠角膜移植模型的建立 腹腔内注射氯氨酮（50mg/kg）+氯丙嗪（25mg/kg）注射液的混合剂全身麻醉。所有动物均选择右眼为术眼，于术前15min起点复方托品酰胺滴眼液及1%地卡因滴眼液各3次，间隔5min。常规消毒铺巾，在手术显微镜下取3.25mm角膜中央全层植片立即植入同等大小角膜中央穿透性植床，用10-0进口尼龙线间断缝合8针，术毕前房内注入少量平衡盐溶液，形成前房。术后5天局部常规应用0.3%妥布霉素滴眼液，每天4次。5天后根据分组不同应用不同滴眼液。
1.2.2 分组 角膜移植术后第5天排除术后发生虹膜嵌顿、前房积血及晶体混浊眼，将手术成功例随机分组，每组10只，见表1。
表1 不同组大鼠角膜移植术后植片的评分以及平均存活时间 （X±s）（略）
三组均为Wistar-SD大鼠组间同种异体角膜移植组，即Wistar为供体，SD为受体。于术后第5天开始应用相应滴眼液，每天5次，直至角膜移植排斥反应发生。A组:滴用空白对照滴眼液，B组:滴用0.03%T II 滴眼液，C组:滴用0.05%FK506滴眼液。
1.2.3 裂隙灯显微镜观察 术后第4天起每2天用裂隙灯 显微镜观察1次，以角膜透明度、水肿度、新生血管为指标，参考Holland等制定的标准 ［8］ ，记录移植排斥指数（rejection index，RI）（0～12分）（见表2）。以角膜混浊、水肿和新生血管3项评分之和为RI，当RI≥6时，为角膜排斥反应发生。记录各组角膜排斥发生的时间。
表2 角膜移植排斥指数评分标准（略）
1.2.4 病理学检查 分别于术后15天及30天，每组分别处死2只大鼠，取其完整眼球，于10%甲醛液固定，常规石蜡包埋，苏木素-伊红染色，Nikon显微镜下观察，摄像。
1.2.5 免疫组化检查 用常规石蜡包埋后的眼球组织，切片固定于有明胶的载玻片上，行EnVision工作程序染色（即改良的ABC染色法），一抗（兔抗大鼠单克隆抗体）:抗CD 25 、抗CD 54 + （均由DACON提供），二抗:羊抗兔血清，阴性对照用PBS代替一抗，DAB显色，苏木素复染，镜检，摄像。
1.3 统计学处理 用SPSS10.0医学统计软件，取术后每个时间点的各组评分均值与该时间行多样本间双因素
方差分析，比较各组间各观察指标间的差异、RI的差异以及排斥发生天数的差异，取P<0.05为差异有显著性，取P<0.01为差异有非常显著性。
2 结果
2.1 A、B、C组之间角膜植片RI随手术后时间延长的评分比较 见表1。各组角膜植片透明度、水肿度、新生血管以及总RI的评分的评分比较:B、C组与A组相比P<0.05，B与C组间相比P>0.05。
2.2 不同组大鼠角膜移植植片平均存活时间以及术后植片的评分情况 见表1。B、C组与A组存活时间相比P<0.05。各组发生角膜移植Kaplan-Meier生存率曲线（见图1）。
2.3 各组典型例术后角膜照片 见图2、3、4。
2.4 病理学检查 光镜，HE染色可见15天时A组角膜植片增厚，角膜上皮细胞增厚，基质中可见大量的淋巴细胞浸润及新生血管形成，缝线处可见异物巨细胞（为吞噬细胞）反应，板层细胞排列不规则;30天时角膜基质变薄，新生血管萎缩，瘢痕形成。B、C组15天可见角膜植片厚度基本正常，角膜上皮完整，基质中仅有少量淋巴细胞浸润，新生血管少见，板层角膜基质细胞排列规则;30天时角膜基质增厚，淋巴细胞和新生血管增多，此时与A组15天时病理表现相似（见图5、6）。
2.5 免疫组化分析 光镜，15天，CD 25 、CD 54 + 在基质中的表达A组明显多于B、C组。30天，这两种细胞因子的表达在B、C组中明显增加，在A组中减少（见图7、8）。
图1 各组角膜移植片的Kaplan-Meier生存率曲线（略）
3 讨论
雷公藤原产我国，产量大，价格便宜，具备较强的抗炎和免疫抑制功能，但全身应用对身体多器官、组织有不同程度的毒副作用，雷公藤多苷虽毒副作用减轻，但全身用药，特别是长期用药仍有一定的副作用。本研究首次研制出T II 滴眼液，局部防治角膜移植排斥反应，发现局部应用T II 滴眼液，不仅能避免雷公藤制剂全身应用所带来的毒副作用，还有显著的抗角膜移植免疫排斥反应的功能。
本研究模型是应用封闭群（closed colony）动物SD和Wistar大鼠之间的角膜移植，有类似人类群体遗传异质性的特点，本研究用封闭群大鼠替代近交系大鼠建立同种异体角膜移植模型是可行的。
本研究首次应用了0.03%T II 滴眼液，该浓度的制定是参考雷公藤甲素（T 10 ）滴眼液产生局部毒性的浓度 ［8］ 和全身应用抑制动物实验性体内炎症的半数有效量（T II 剂量约是T 10 的300倍） ［9］ ，即当选定T 10 滴眼液浓度为1μg/ml时，T II 滴眼液相应的浓度为300μg/ml。
本研究从结果中可以看出0.03%T II 滴眼液对角膜排斥反应的抑制在各个指标评价中与0.05%FK506滴眼液疗效近似。其原因可能是由于T II 有多种抗炎及抑制免疫的组分。IL-2主要由T细胞或T细胞系产生。CD 25 是活化T淋巴细胞的标志。当角膜移植发生免疫排斥时，同种异体抗原主要刺激CD 4 阳性T细胞分泌IL-2。因此，IL-2在角膜移植片中基质层的多少可间接反映出移植片中T细胞的浸润数量及免疫排斥发生的程度。ICAM-1广泛表达于白细胞、巨噬细胞和成纤维细胞上，可作为反映角膜移植片 中炎症细胞浸润程度的客观指标，其表达的多少在角膜移植排斥反应发展进程中起重要作用 ［10］ 。应用T II 滴眼液后15天组植片中的IL-2、ICAM-1的表达明显少于同一时间的A组，表明T II 滴眼液可通过抑制T细胞和炎症细胞的浸润来抑制角膜抑制排斥反应的发生。这与体外T II 对T细胞周期中的各个关键点均有抑制作用 ［11］ ，在转录水平上抑制Th细胞IL-2和IL-2Rp55基因表达，并能促进IL-2mRNA降解 ［12］ ，以及抑制单核细胞和淋巴细胞炎性细胞因子TNF-α的产生 ［12］ 等研究结果相一致。
T II 滴眼液的研制成功不仅可应用于防治角膜移植排斥反应，而且对于治疗眼前部其它各种免疫性眼病，如:前部葡萄膜炎、巩膜炎、免疫性角膜病、春季卡他性结膜炎、青睫综合征等以往需用激素治疗的疾病，提供了新的治疗途径和前景。不仅避免了雷公藤制剂全身应用所带来的副作用，扩展了其应用对象（如:针对雷公藤不能全身应用的妊娠妇女），而且提高了眼组织局部的有效药物浓度，为小剂量长期应用提供了可能性。
（本文图2～8见封三）（略）
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ˇ 基金项目:广东省中医药管理局科研课题资助项目（100067）及广东省卫生厅医学科学技术研究基金资助项目（A2001323）
作者单位:518001广东深圳暨南大学医学院附属深圳眼科中心，深圳市眼科医院
510632广东广州暨南大学医学院眼科（ △ 组织移植免疫中心）