输血相关病毒母婴传播的分子病毒学的临床研究

　　【摘要】 目的 了解输血相关病毒（TTV）在我国母婴传播的可能及分子病毒学依据。方法 应用PCR调查我院2002年1～12月间住院的174例产妇及其新生儿的TTV感染情况，用克隆后序列分析测定两对母婴同时阳性者TTV基因序列。结果 在174例产妇中有24例用半巢式PCR可检测出TTV，检出率为13.8%，其中4例产妇与新生儿同时阳性（4.6%）;配对比较两对母婴TTV序列片段（1915～2185核苷酸片段）同源性均为100%。结论 TTV在我国可通过母婴传播的途径感染，此结果丰富了对TTV传播途径的认识。TTV对胎儿的危害及新生儿生长发育的影响值得进一步研究。

　　TTV transmission from mother to infant  

　　Chen Yong，Du Jianping
    
　　Dept.of Blood Transfusion of He-Ze Municipal Hospital，Shandong274000.
     
　　【Abstract】 Objective Mother to infant transmission of a novel virus named TT virus was investigated in sera from174mothers and their infants.24cases（13.8%）of the mothers were found to harbor TTV in serum by a semˉinested PCR using a set of primers from conserved region in the TTV genome.Among them there were4infants and their born mothers possessed positive sequences simultaneously（4.6%）.We carried out cloning sequencing of the amˉplicons with BAI310automated sequencer using primer T7or SP6as sequencing primers.Homology analysis was done with sequences between positions1915and2185of the published TTV genome.Analysis of TTV sequences from the infected mother and their infected child confirmed a genetic link between the virus of the mother and the infected child.This study indicates there is a possibility of mother to infant transmission of TTV in China.

　　Key words mother to infomt tromsmission TTV virus  

　　1997年国外学者发现了一种可能与输血后肝炎相关的病毒（即TTV） ［1～3］  。国内在某校学生暴发流行的一次以单项转氨酶升高为特点的肝炎患者的血清与粪便中也检测出该病毒，证实了国内TTV感染的存在 ［4］  。进一步的研究发现在自然人群、各型肝炎患者、暴露于血及血制品的高危人群中均有较高的检出率，在自然人群中感染TTV检出率为12%～19%。为了解TTV在我国母婴传播的可能及分子病毒学依据，笔者用半巢式PCR调查我院174例产妇及其新生儿的TTV感染率，用克隆后序列分析测定两对母婴同时阳性者TTV基因序列。结果报道如下。

　　1 资料与方法

　　1.1 研究对象

　　1998年1～12月期间住院的174例正常产妇，年龄21～37岁，ALT均正常。出生时同时采集母婴配对血清，所有血清标本均于-30℃保存，集中检测。所有产妇HBsAg和抗-HCV均为阴性。

　　1.2 肝炎标志物检测

　　HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc、IgM、抗-HCV均以酶免疫法检测。

　　1.3 DNA抽提 ［5］  

　　血清和蒸馏水50μl混匀稀释后，加入100μl裂解液（25mmol/L醋酸胺，2.5mmol/L EDTA，1%SDS，2mg/ml蛋白酶K）和10μg/ml tRNA载体，68℃消化2h后，常规苯酚和氯仿法抽提。

　　1.4 PCR扩增TTV DNA ［6］  

　　用半巢式PCR，第1轮引物用NG0635’-CTGGCATTT-TACCATTTCCAAAGTT，第2轮引物用NG0615GGCAACATGTTATGGATAGACTGG和NG063。第2轮PCR反应条件:取模板3μl，10×PCR反应缓冲液3μl，d NTP各200μmol/L，NG059/NG063各15pmol，Taq DNA多聚酶1.5U，总反应体积30μl。94℃预变性180s，93℃40s，54°40s，70℃60s，扩增30个循环，70℃180s，结束反应。取第1轮PCR产物3μl作模板，用NG061/NG063引物进行第2轮扩增，扩增条件同第1轮循环。取PCR产物10μl于2%琼脂糖凝胶中电泳，EB染色，紫外灯下观察结果。

　　1.5 克隆序列分析

　　方法见文献 ［5］  ，随机选择两对母婴TTV均阳性第2轮PCR产物经电泳纯化，克隆入T载体（Promega Co.）。重组克隆经酶切鉴定后，用ABI310全自动测序仪测序。测序引物用T7和SP6。得到的TTV序列片段（1915～2185核苷酸片段）与通过互联网下载的基因库TTV日本株比较（序列号AB008394）。

　　2 结果

　　2.1 产妇和新生儿中TTV检出率

　　174例产妇中24例用PCR扩增出预定大小270bp的条带，说明有24例产妇可检出TTV感染，检出率为13.8%。其中8例产妇与新生儿同时检出，阳性率为4.6%。所有TTV阳性的产妇与新生儿血清ALT均在正常范围。

　　2.2 序列测定及同源性分析

　　用克隆后测序分析两对母婴配对TTV片段序列（核苷酸1915～2185），并与通过互联网下载的基因库TTV日本株比较（序列号AB008394），发现1号家庭母亲和婴儿感染的序列完全相同，同源性为100%，但与日本株比较均有1个核苷酸差别。2号家庭母亲和婴儿感染的序列也完全相同，但与日本株比较均有2个核苷酸差别，与1号家庭感染的毒株有1个核苷酸差别。

　　3 讨论

　　TTV为单链环状病毒，可能属于环状病毒科，它与某些动物单链病毒如微小病毒B19相近似 ［1，6～8］  。该病毒的全基因组已克隆。Okamoto等 ［6］  对日本供血员及各型肝炎患者、暴露于血及血制品的高危人群血清进行了TTV检测。结果，非甲-庚型慢性肝病患者中检出率为46%，重型肝炎患者为47%，肝硬化者为48%，静脉注射毒品成瘾者为40% ［6］  ，供血者检出率为12%，明显低于其它组患者。最先报道认为TTV经过血液和血液制品传播。国内骆抗先等 ［4］  通过对某校暴发流行的一次以单项转氨酶升高为特点的肝炎患者做了详尽的流行病学调查，首先证实TTV可经过消化道传播。不同人群中高的TTV感染率提示TTV有经母婴传播的可能性。为了解TTV在我国母婴传播的可能，笔者用半巢式PCR调查174例产妇及其新生儿的TTV感染率，发现24例产妇用半巢式PCR可检测出TTV，检出率为13.8%。在日本一项研究发现21例TTV阳性母亲所生的婴儿42.9%在出生后4个月内成为TTV阳性 ［9］  。且发现母乳喂养时间长的婴儿，感染TTV的机会大，所有感染TTV的婴儿均肝功能正常，该研究说明TTV有经母乳喂养产后水平传播的可能。本研究发现24例感染的产妇，有8例出生婴儿感染TTV，且出生后的静脉血和脐血均阳性。这一结果证实TTV母婴传播的可能，且在宫内已感染的可能性最大。笔者用克隆后测序分析了其中的两对母婴配对TTV片段序列，发现2个家庭母亲和婴儿感染序列完全相    同，同源性均为100%，但2个家庭之间序列以及与日本株 比较均有核苷酸差别。这一结果进一步从分子水平阐明TTV母婴传播的可能，丰富了对TTV传播途径的认识。TTV与微小病毒B19同源性较高，微小病毒B19宫内感染可致胎儿水肿和流产。因此，有关TTV对胎儿的危害及新生儿生长发育的影响值得进一步研究。

　　参考文献
    
　　1 Nishizawa T，Okamoto H，Konishi K，et al.A novel DNA viru（TTV）asˉsociated with elevated transaminase levels in post-transfusion hepatitis of unknown etiology.Biochem Biophys Res.Commun，1997，241:92.

　　2 P Simmonds，F Davidson，CL Ycett，et al.Detection of a novel DNA virus（TT virus）in blood donors and blood products.Lancet，1998，352:191.

　　3 Naoumov NV，Petrova EP，Thoumas MG，et al.Presence of anewly deˉscribed human DNA virus（TTV）in patients with liverdisease.Lancet，1998，352:195.   

　　4 骆抗先，章廉，王珊珊，等.一种新型肠传性病毒性肝炎的流行病学、临床、病理和病毒学的初步研究.第一军医大学学报，1998，18:87.

　　5 Jhou，Karayiannis P，Waters J，et al.Unique insertion in the Sgene of surface antigen-negative hepatitis B virus Chinese carri-ers.Hepatolˉogy，1995，21:273.

　　6 Okamoto H，Nishizawa T，Kato N，et al.Molecular cloning andcharacteriˉzation of a novel DNA virus（TTV）associated withposttranfusion hepatiˉtis of undnown etiology.Hepatology Res，1998，10:1.

　　7 黄呈辉，周育森，陈汝光，等.献血员中病毒检测及部分序列测定.中华实验和临床病毒学杂志，1998，12:237.

　　8 Y Cossart.TTV a common virus，butpathogenic?Lancet，1998，352:196.

　　9 Inaba N，Oshima K，Okajima Y，et al.TTV materno-infantile in-fecˉtion-a study on the TTV frequency in Japanese pregnantwomen and the natural histry of TTV mother-to-infection.Nip-pon Rinsho，1999，57:1406.     

　　作者单位:274000山东省菏泽市立医院输血科