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Study on Bcl-2，Fas genes expression relation after rats global cerebral ischemia
Li Guanghua，Miao Qing
Department of Neurology，The Second Hospital of Har Bin，Heilongjiang150056.
【Abstract】 Objective To observe protein expression of Bcl-2，Fas following global ischemia in rats of difˉferent time，show protein expression of Bcl-2，Fas producing the procession and the rule.Reference time table was provided for using medicine in treatment and xperiment.Methods Global ischemic model in rats was established by4-vessel occlusion.The animal was killed in different time after reperfusion.Morphological damage was observed after fetching brains of the rats，burying the brains with wax，staining themwith HE，cutting and doing immunohistochemistry of Bcl-w，Fas by light microscope.Results Expression of Bcl-2protein tended to increase in early time，namely in24hours after reperfusion，and was most at24hours.The tendency of Bcl-2protein expression showed reduce after24hours.Fas expressed the increase trend in the increase time point of delayed neuronal death.Conclusion The exˉpression of Bcl-2may be closely related to neuron survival and protect the ischemia neuron from being injured.The expression of Fas protein can induce the apoptosis after ischemia and may be related to the activation signal of delayed neuronal death.Key words cerebral ischemia Bcl-2protein Fas protein
全脑缺血在临床上多发生于心律失常、心肌梗死以及休克等造成的脑部血液灌流量低，缺血范围广。大鼠全脑缺血动物模型与临床上脑缺血虽不完全相同，但全脑缺血后Bcl-2、Fas蛋白表达情况的研究对于临床上在脑缺血后的治疗方面具有指导意义。同时研究Bcl-2和Fas蛋白在缺血损伤细胞中的表达，并发现二者在表达上存在的内在相互关系，目前在国内还是首例，如果能将研究结果运用到临床实践工作中，在损伤细胞中促进Bcl-2蛋白表达，阻止Fas蛋白在损伤细胞中的表达，那么就能够挽救“半暗带”中的细胞生命，使缺血损伤细胞数量减少在最小范围内，这正是本实验的价值和临床意义所在。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物 健康成年雄性Wistar大鼠77只，体重280～340g。
1.1.2 主要试剂 麻醉剂、光镜灌注液及固定液、染色剂、免疫组化试剂:兔抗大鼠Bcl-2抗体、兔抗大鼠Fas抗体、SABC试剂盒。
1.2 实验方法
1.2.1 分组 将77只大鼠随机分为:正常组、假手术组、单次缺血8min组，分别于缺血后2h、6h、14h、24h、2天、3天、5天、7天、14天，于不同时间点处死大鼠，每组7只，总共分组11组。
1.2.2 手术 称重、麻醉、暴露并分离颈总动脉和迷走神经、电凝椎动脉、夹闭缺血:24h后夹闭双侧颈总动脉，造成4血管闭塞全脑缺血，缺血8min。处死:在缝合后2h、6h、14h、24h、2天、3天、5天、7天、14天，不同时间点处死大鼠，取脑进行48h外固定。正常组7只大鼠不做任何处理。假手术组7只，手术操作程序与实验组相同，电凝椎动脉后，不做颈总动脉夹闭，亦于不同时间点处死大鼠。
1.3 免疫组化标本制备 取材、脱水、透明、浸蜡、包埋粘块、切片、免疫组化采用SABC法，Bcl-2单克隆抗体，Fas单克隆抗体，Ⅰ抗和Ⅱ抗工作液均购于武汉博士德公司。
1.4 光镜下观测
2 结果
2.1 免疫组化结果 Bcl-2和Fas蛋白表达，在放大400倍的显微镜下，观察同一位的皮层、海马的神经细胞及神经胶质细胞的阳性细胞情况，表示结果的方法是:（-）表示:几乎没有Bcl-2和Fas蛋白表达，阳性细胞数≤10%;（+）表示:少量Bcl-2和Fas蛋白表达，阳性细胞数在10%～40%之间;（++）表示:中等度、较多Bcl-2和Fas蛋白表达，阳性细胞数在40%～70%之间;（+++）表示:最强烈Bcl-2和Fas蛋白表达，阳性细胞在70%～100%之间。
2.2 Bcl-2蛋白表达结果 正常组及假手术组未见Bcl-2蛋白表达，其阳性细胞为细胞膜及细胞浆呈棕黄色染色。Bcl-2蛋白阳性反应细胞于再灌注2h开始个别细胞出现表达，24h内随再灌注时间增加阳性反应细胞迅速增加，增加数量明显，于再灌注24h细胞阳性表达最多，达到高峰，随后于再灌注第2天、第3天，明显下降，第5天、第7天有少量阳性细胞表达，第14天几乎没有阳性细胞表达。Bcl-2蛋白表达的范围以皮层为主，海马CA1区有表达，但CA1区表达数量较皮层少。
2.3 Fas蛋白表达结果 正常组及假手术组未见Fas蛋白表达，其阳性细胞为细胞膜、细胞浆及细胞核呈棕黄色染色，Fas蛋白阳性反应细胞于再灌注2h最早开始出现，但阳性细胞数量不多，24h内随着再灌注时间增加阳性细胞数量略有增加，但不是很明显。随后的第2天、第3天阳性细胞数量逐渐增加，于再灌注第5天Fas蛋白表达最多，以后第7天、第14天Fas蛋白表达数量出现下降，Fas蛋白表达广泛分布于皮层及海马的神经细胞及神经胶质细胞，对缺血较敏感的海马大锥体细胞亦有表达。
2.4 Fas与Bcl-2蛋白表达光镜观察结果 见表1。表1 Fas与Bcl-2蛋白表达光镜观察结果
3 讨论
Bcl-2是与迟发神经元引起细胞凋亡密切相关的基因，在细胞凋亡调控中起重要作用 ［1，2］ 。根据本实验结果显示，Bcl-2蛋白的表达在皮层于再灌注2h开始出现，再灌注24h达高峰，再灌注2天表达呈下降趋势，再灌注5天表达明显减少。表明24h内Bcl-2表达逐渐增加，表明缺血后刺激Bcl-2蛋白的合成过程，在此期间损伤细胞数量少，Bcl-2蛋白在缺血后再灌注受损伤细胞减少的时间点上表达增强;24h后随着再灌注时间延长Bcl-2表达呈下降趋势，并且在这段时间，损伤细胞数量逐渐增加;因此Bcl-2蛋白表达可能与神经细胞存活密切相关，并对神经元起保护作用，从而进一步证实Bcl-2基因对缺血性脑损伤 具有保护作用。
从CA1区观察结果来看:Bcl-2蛋白在海马CA1区的表达趋势和皮层的表达趋势是一致的，但表达的强度弱，因为海马CA1区神经元对缺血较敏感，Bcl-2在该区表达减弱，表明Bcl-2蛋白在神经元对缺血敏感性起重要作用，同时也证明了Bcl-2与缺血性神经元损伤的保护作用有关。有关Bcl-2抗凋亡的作用机制目前认为有以下几个方面 ［1，2］ :（1）抑制Ca 2+ 的释放:现已证明Bcl-2是一种跨膜蛋白，主要分布于核膜和胞浆内质网。我们实验也证实Bcl-2分布于核膜周围，少数分布于胞浆。核膜上Bcl-2蛋白并非随机分布而是集中于核孔复合物（NPC）区域。核内外膜之间由质网管腔相联，而管腔中是细胞内钙离子的主要贮存处，而Ca 2+ 在细胞凋亡过程中起重要作用，应用转基因方法发现Bcl-2高表达可抑制内质网释放Ca 2+ 。因此有人推测Bcl-2对细胞凋亡的抑制作用可能与细胞内质网中Ca 2+ 有关。（2）Bcl-2通过阻止促凋亡基因信号传递或阻止这些诱导基因产物发挥作用，如Bcl-2蛋白可抑制p53诱导的细胞凋亡等。（3）Bcl-2通过抑制自由然而发挥抗凋亡作用。有人发现Bcl-2具有抗氧化剂作用，它可能抑制超氧化物的产生和作用，从而抑制细胞凋亡的发生。Fas是一种具有重要功能的细胞表面受体，它与Fas配体结合可以诱导Fas阳性细胞凋亡 ［3］ 。Fas又称死亡分子，其在许多组织中表达被认为与该组织疾病有关 ［4］ 。根据本实验结果:Fas阳性细胞分布广泛，大脑皮层、海马的神经元及神经胶质细胞均有表达，对缺血较敏感的海马大锥体细胞也有阳性表达。Fas蛋白表达于再灌注2h开始出现，24h内变化不明显，从再灌注第2天开始增加，再灌注第5天达高峰，再灌注第7天、第14天出现下降。根据Fas蛋白表达结果可以看出:Fas蛋白表达结果的增加与细胞缺血再灌注迟发神经元的死亡数量是相一致的，即随着Fas蛋白表达逐渐增多，损伤神经元的数量亦不断增多，说明Fas介导了脑缺血后细胞凋亡的发生，并可能诱导了迟发性神经元死亡（DND）。值得提出的是以往的实验结果表明:Fas蛋白主要分布于细胞膜与细胞浆中;而我们的实验结果是:Fas蛋白不仅分布于细胞膜与细胞浆中，而且也分布于细胞核中，其原因目前还不清楚。目前有关Fas与DND的关系国外学者观点不十分一致。Matsuyama ［5］ 认为Fas不直接诱导DND的发生，而在兔脊髓缺血发生迟发运动神经元死亡的实验研究中，作者认为Fas诱导了脊髓缺血后运动神经元迟发性死亡，并与脑缺血后海马神经元凋亡相似 ［6］ 。本文同意该作者观点，并结合本实验结果认为，Fas不仅诱导脑缺血再灌注后细胞快速凋亡，并且可能参与了DND的发生。Bcl-2和Fas作为调控迟发性神经元死亡的重要基因，二者在脑缺血后引起细胞凋亡中发挥着极其重要的作用。但是其调控机制十分复杂，涉及许多相关基因，还有待我们进一步研究。
参考文献
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3 Salurai M，Hayashi T，Abe K，et al.Belayed selective motor neuron death and fas antigen induction after spinal cord ischemia in rabbits.Brain Res，1998，22:797.
4 Itoh N，Yonehara S，Ishii A，et al.The poly peptide encoded by the cDˉNA for human cell surface antigen fas can mediate apoptosis.Cell，1991，66:233.
5 Matsuyama T，Hata R，Tagaya M，et al.Fas antigen mRNA induction in postischemia murine brain.Brain Res，1994，657:324.
6 Sakurai M，Hayashi T，Abe K，et al.Belayed selective motor neuron death and fas antigen induction after spinal cord ischemia in rabbits.Brain Res，1998，22:797.
作者单位:150056黑龙江省哈尔滨市第二医院神经内科