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Study on the Immune Function of KM Mice in SPF grade
Wang Yu’e，Lin Qiao，Lu Xiaocong
Hubei Academy of Preventive Medicine，Wuhan430079.
【Abstract】 Objective To examine the immune function of KM mice in SPF grade from National Laboratory Animal Breeding Center.Methods The following test methods was used，removing carbonaceous granul，DTH induced by DNFB and the mice’s lymphocyte transformation induced by ConA.Results The each index tested in KMmice in SPF grade as following.The thymus index is4.93～5.53，spleen index4.30～4.78，DHT13.18～22.62，OD value of the mice’s lymphocyte transformation induced by ConA is0～0.051，B lymphocyte252.12～444.28，the index K of removing carbonaceous granul0.0042～0.043and phagocytic indexα3.14～5.57，the phagocytic function of macrophages in mice’s abdominal cavities index and percent are0.25～0.41and20.66～36.10respectively，NK cell percent9.79～24.87，antibody level15.47～75.01.All of the data above mentioned confidence is95%.Conˉclusion The results have enriched the basic immunities data of KMmice in SPF grade in National Laboratory Animal Breeding Center.
Key words KM mice SPF immune function
随着科学技术和社会文明的进步和发展，人们更加关注生命的质量。近年来，治疗疾病药物和功能性保健食品均有着广泛的市场。在开发和筛选抗肿瘤疾病、免疫性疾病、提高免疫水平和延缓衰老的药品及功能性保健食品中，我国学者大多使用KM小鼠来进行相关的动物试验，并以细胞、体液免疫等方面的免疫学指标进行有效性的判断 ［1～4］ 。因此KM小鼠的各项免疫学指标是一重要的生理参数。目前尚未见对北京国家种子中心SPF级KM小鼠免疫功能学的报道，为此我们选用药理和保健食品检验上常用的8种检验方法对北京国家种子中心SPF级KM小鼠免疫功能进行研究。报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物 SPF级KM小鼠，体重为30～40g，雌雄不限。由湖北省实验动物研究中心提供。引自北京国家实验动物种子中心。
1.1.2 试剂 RPMI1640培养液;ConA液;溴化甲噻唑基四唑;Hanks液;酸性异丙醇;二硝基氟苯;硫化钡脱毛剂;绵羊红细胞;豚鼠血清补体;印度墨法;0.1%碳酸钠溶液;20%（v/v）鸡红细胞;姬氏染液;1:1丙酮;甲醇。
1.1.3 仪器 24孔培养板、96孔培养板（平底）二氧化碳培养箱、酶联检测仪、721分光光度计;超净工作台、200目筛网、无菌滤器、组织匀浆器、直径8mm打孔器、离心机、恒温箱、血凝板、显微镜。
1.2 实验及计算方法 ［5］
1.2.1 称重法测定脏器系数。脏器系数=（脏器重量/体重）×1000。
1.2.2 耳肿胀法测定二硝基氟苯诱导小鼠迟发型变态反应。用左右耳重量之差表示DHT的程度，表示迟发型变态反应程度。
1.2.3 MTT法测定ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验。用加ConA孔的光密度值减去不加ConA的光密度值代表淋巴细胞的增殖能力。
1.2.4 乳酸脱氢酶测定法检测NK细胞的活性。按NK细胞活性（%）=［（反应孔OD-自然孔OD）/（最大释放孔OD-自然释放孔OD）］×100%计算。
1.2.5 Jerne改良玻片法测定抗体生成细胞。以溶血空斑数反映抗生成细胞数。
1.2.6 碳廓清法测定网状内皮系统的巨噬细胞的吞噬能力。K为廓清指数，α为吞噬指数。K=（lgOD 1 -lgOD 2 ）/（t 2 -t 1 ），吞噬指数α=［体重/（肝重+脾重）］×K 1/3 。OD 1 、OD 2 ，分别代表用721分光光度计在600nm波长时的光密度值，t 2 、t 1 分别代表不同时间。
1.2.7 半体内法测定小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力。吞噬百分率（%）=［吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/计数的巨噬细胞数）×100%;吞噬指数=被吞噬鸡红细胞总数/计数的巨噬细胞数
1.2.8 血凝法测定血清溶血素的水平。记录其凝集SRBC的程度，按下式计算抗体积数，以抗体积数来表示抗体水平。抗体水平=（S 1 +2S 2 +3S 3 +……nS n ），式中1、2、3、 ……n代表对倍稀释的指数，S表示凝集程度的级别，抗体积数越大，表示血清中抗体水平越高。
1.3 统计学分析 数据用Microsoft Excel统计，进行t检验。
2 结果
SPF级KM小鼠脾及胸腺重量及脏器系数、DHT值、NK细胞活性、ConA诱导的脾淋巴细胞转化OD值、抗体生成细胞、血清抗体水平、廓清指数及吞噬指数、腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬指数及百分率，见表1、表2、表3。
表1 SPF级KM小鼠脾及胸腺重量及脏器系数、DHT值 （略）
表2 SPF级KM小鼠的ConA诱导的脾淋巴细胞转化OD值及NK细胞百分率（略）
表3 SPF级KM小鼠的免疫学参数（略）
3 讨论
KM小鼠1944年从Haffknie研究所引入中国昆明 ［6］ ，作为实验动物用于生物医学研究已有半个多世纪之久。它在我国生物医学动物实验中的占有率约为70%。我国科技工作者对KM小鼠进行了大量的科学研究，积累了许多数据和资料 ［7～9］ 。叶钟灼（1995）、周虹（1997）、卢笑丛（1999）分别报道过普通级KM小鼠红细胞免疫功能、血清RaRF的补体激活活性、5项免疫学指标 ［10～12］ 。由于我国地域辽阔，导致KM小鼠各地逐渐形成了许多亚群 ［13］ ，而各群间的生物学特征有所差异 ［14～16］ 。为了使实验结果的准确性、可靠性及可重复性高，我国实行了实验动物标准化。
实验动物的标准化首先要求微生物控制标准化，强调必须使用清洁级以上的实验动物。刘淑霞等 ［1］剖检1287只2个群体的普通级KM的繁殖群小鼠，发现肺部病变19.20%（192/1000）和11.85%（34/287），肝脏病变分别为:20. 7%（207/1000）、5.57%（16/287），脾脏病变分别为:18.0% （18/1000）、4.88（14/287），其它器官系统也出现程度不同的病变。所以普通级小鼠群将影响科研、生产、鉴定等试验结果。实验动物的遗传背景也必须标准化，否则实验没有可重复性可言。张周等 ［18］ 采用上海A、B、C3家专业实验动物繁育生产单位的KM小鼠进行景洪哥纳香甲素（GC-51）对KM小鼠肝癌实体瘤抗癌作用的重复实验并测定了其胸腺、脾脏重量。结果表明该药物对不同单位KM小鼠的抑瘤率差异有显著性（P<0.01）。3家单位KM小鼠的胸腺、脾脏重量差异有显著性（P<0.01）。这一结果显示实验动物遗传背景会影响试验结果的判断。
为了使实验动物标准化，国家规定各地实验动物中心的种子群必须由北京或上海的国家实验动物种子中心提供 ［19］ 。这样北京国家实验动物种子中心的SPF级KM小鼠就有了分布广、辐射面大和影响力强的特点，因此对该群的KM小鼠进行深入研究是有必要的。免疫学开始于巴斯德（1879）的减毒菌苗实验，如今在阐明发病机制、诊断和防治免疫性疾病、传染病、遗传性病、肿瘤以及器官移植、药物及功能性保健食品的筛选等方面，起着重大的作用。本实验从参与细胞免疫的淋巴细胞系统如T淋巴细胞、B淋巴细胞及NK细胞;参与细胞免疫的单核吞噬细胞系统如巨噬细胞;参与特异性体液免疫的抗体;中枢免疫器官及外周免疫器官等方面对SPF级KM小鼠进行了系统研究，既丰富了北京国家实验动物种子中心SPF级KM小鼠的免疫学背景，也为各地应用该群小鼠进行有关免疫学实验提供了一定的参考依据。
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19 科学技术部、卫生部、教育部、农业部、国家质量监督检验检疫局、国家中医药管理局、中国人民解放军总后勤部卫生部文件.国科发财字［2001］545号关于发布《实验动物许可证管理办法（试行）》的通知.
作者单位:430079湖北省预防医学科学院
430074湖北武汉中国科学院武汉植物研究所