荧光分光光度检测下颌滑液中一氧化氮浓度

　　一氧化氮（Nitric Oxide，NO）是一种毒性强、化学特性极为活泼的自由基。在体内具有广泛的生物学特征。参与免疫、神经、骨骼、消化等等多种系统生理功能的调节和病理的发生、发展过程。本文建立一种改良的荧光分光光度法间接地检测下颌关节病（TMD）滑液中一氧化氮（NO）的浓度。为探讨NO在TMD病理过程中的作用和进一步的临床治疗提供一种重要的检测指标。

　　　1 材料和方法

　　　1.1 主要仪器与试剂 RF-510型荧光分光光度计（日本，岛津），XW-80A型旋涡混合仪（国产，上海），TDL-40B型离心机（国产，上海）。2，3二氨基萘（2，3-diaminonaphˉtnhalene，DAN）Adresh进口，亚硝酸钠（NaNO 2 ）、乙二胺四乙酸二钠（EDTA，2Na）、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、三羟甲基氨基甲烷均为国产分析纯。

　　　1.2 样品预处理与分析条件

　　　1.2.1 样品采集 取患者或对照组正常人下颌关节部位穿刺，以生理盐水2ml反复冲洗5次，抽取滑液，密闭条件下，立即送实验室，置3000转/min，离心10min，取上清液移至-70℃保存，待测。

　　　1.2.2 样品预处理 上清液0.5ml加入无离子双蒸水4.5ml，加入0.005%DNA0.05ml，立即混合后，置20℃水浴10min，加入0.58NaOH0.15ml，再次立即混匀后加入Tris-HCl pH7.0缓冲液0.15ml后荧光比色检测。

　　　1.2.3 仪器分析条件 设定RF-510荧光分光光度计（EX）365nm，带宽20mm;（EM）405nm，带宽5mm，Range×1，比色池为4ml容量比色杯。

　　　2 结果

　　　2.1 外标标准工作曲线 NO -2 浓度在5～30nmol/L范围之内，呈良好的线性（r=0.998）。

　　　2.2 回收率 样品中加入已知量NaNO 2 标准物按照样品预处理程序衍生，分析NO -2 浓度，对照标准曲线计算回收率结果为95.5%～102%，平均值98.4%（n=10）。

　　　2.3 最低检出限（灵敏度） 按照本文方法检测标准品中NO -2 最低浓度为5nmol/L。

　　　2.4 一氧化氮浓度计算 采用外标标准工作曲线法定量求出样品中NO浓度或按如下公式计算: 样品NO=（样品荧光值-空白管荧光值）×标准品浓度标准品荧光值-空白管荧光值图1 NO外标工作曲线    图2 DAN反应温度对NO检测荧光强度的影响

　　　3 讨论

　　　根据2，3二氨基萘（2，3-diaminonaphtnhalene，DAN）在酸性条件下与NO -2 反应生成具有强荧光性的2，3萘酚三唑衍生物的特性。采用荧光光度法可以特异性的间接检测组织、血液等样品中一氧化氮浓度的方法已有文献报道 ［1，2］  ，但是检测下颌滑液NO浓度的报道甚少。由于下颌滑液采样要求操作技术高、样品量少、NO含量低等特殊因素的影响，一般方法难以检测出样品中的NO浓度。因此建立一种检测灵敏、回收率高、重现性好并且操作简便、稳定的方法尤为重要。故此我们改良并建立了NO的检测方法，并应用到下颌滑液样品中NO检测工作中，并获得满意的结果。方法中所涉及到改良的操作步骤为:（1）样品除蛋白步骤的改进:以往文献对样品除蛋白均采用磺基水杨酸去蛋白，氯仿去脂肪，然后离心取上清等步骤的抽提方法。操作繁琐，且损失样品，影响NO检测的灵敏度和重现性。我们采用Millipore进口微孔超滤膜（0.22μm）和实验室自制离心超滤管，直接经12000转/min，离心15min，处理样品，除去样品中蛋白、脂肪等干扰物，取上清液直接DNA衍生，检测NO浓度，简化了样品预处理步骤，经方法学考证回收率和重现性良好，可以保证受检样品中NO实际浓度的准确性和分析方法的灵敏度，并且避免了有毒试剂对人体的危害。（2）DAN衍生试剂用量方面:为了满足样品中NO -2 与DAN反应完全，许多作者往往添加过量的DAN与之反应。殊不知由于荧光分光光度法检测NO时本身并不具备对样品中DAN衍生物的分离功能。样品过量的DAN同样可使检测样品时荧光本底升高，覆盖样品中NO实际含量。最终影响检测结果的灵敏度，甚至导致实验失败。因此，本文设计一种合理的DAN用量即可达到满足样品中NO的衍生完全，而且还保证过剩的DAN试剂不掩蔽DAN-NO衍生物的荧光信号，从而提高检测的灵敏度，使得下颌滑液NO检测获得满意结果。实验中，同样考察了在DAN衍生过程中，反应温度和时间对NO结合的影响，结果表明DAN衍生过程中，对反应温度的影响很显著，反应温度低产物荧光强度低，反之温度 升高荧光强度随之增强（见图2）。因此，操作时要求严格控制反应温度，不容忽视。另外，反应时间也应同时固定，才能获得准确的检测结果。利用本文方法已经完成100余例下颌滑液样品中NO检测。结果满意，有关下颌关节病与NO浓度之间的相互关系以及其病理改变的机制和临床治疗方面的探讨容另文报道。

　　　参考文献

　　　1 田亚平，沈文梅.荧光方法直接测定一氧化氮.生物化学与生物物理进展，1999，26（3）:273-276.

　　　2 王吉村，莫简，孙长凯，等.组织及组织液中一氧化氮的荧光分光光度法检测.第四军医大学学报，1995，16（6）:463-464.

　　　3 孙长凯，鞠躬，王栋，等.一氧化氮研究的几个基本问题:Natl Med J China.1996，76（8）:626-628.

　　　4 Robert K，Goldman，Angelo A.Nitrosothiol Quantification inhumanPlasma.TrunkeyAnalyticalBiochemistry，1998，259，98-103.

　　　作者单位:1300211天津市泌尿外科研究所

　　　天津医科大学第二医院