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首页合作平台在线期刊中华医药杂志2004年第4卷第12期论著

N-CWS对小鼠巨噬细胞的活化效应

来源:INTERNET
摘要:【摘要】目的探讨N-CWS的抗癌机制与其免疫功能的相关性。方法采用免疫学方法检测N-CWS对小鼠腹腔巨噬细胞(M)的吞噬功能和抑瘤活性的影响。结果N-CWS对小鼠肉瘤S180的生长有明显的抑制作用,N-CWS明显激活小鼠腹腔M,增强对肿瘤细胞的细胞毒效应,显著提高M的吞噬活性。结论N-CWS的抗癌作用与M的激活有关。...

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    【摘要】 目的  探讨N-CWS的抗癌机制与其免疫功能的相关性。 方法  采用免疫学方法检测N-CWS对小鼠腹腔巨噬细胞(M)的吞噬功能和抑瘤活性的影响。 结果  N-CWS对小鼠肉瘤S 180 的生长有明显的抑制作用,N-CWS明显激活小鼠腹腔M,增强对肿瘤细胞的细胞毒效应,显著提高M的吞噬活性。 结论  N-CWS的抗癌作用与M的激活有关。
      
    
  Activation effect of N-CWS on macrophage of mice
     
  Zhang Zhulan,Huang Yingzhen,Tang Wenli,et al.

  Fujian Institute of Microbiology,Fuzhou350007.   
     
  【Abstract】 Objective To investigate the relation between antitumor mechanism and the immunological func-tion of N-CWS.Methods Immunological methods were used to test the phagocytosis and antitumor activity of macrophage in abdominal cavity activated by N-CWS.Results Macrophage activated by N-CWS inhibited obvi-ously the development of sarcoma S 180 in mice,N-CWS obviously activated macrophage inmice abdominal cavity,and enhanced the cytoxic effect against tumour and phagocytotic activity of macrophage.Conclusion The antitumor func-tion of N-CWS was relative to the activation of Macrophage.
     
  Key words N-CWS macrophage MTT assay phagocytotic activity
      
  N-CWS(Nocardia rubra Cell Wall Skeleton,红色诺卡氏菌细胞壁骨架)、BCG-CWS对实验性肿瘤及人的恶性肿瘤都有明显的抗瘤作用 [1,2] 。日本学者山村雄一、东市郎等 [3] 人认为N-CWS的抗癌效应更为明显。我所从昆明土壤中分离到1株红色诺卡氏菌PO-8,并研究成功N-CWS冻干剂,动物实验和临床研究证明它能防止肿瘤发生和抑制癌细胞生长,可改善晚期肿瘤患者的临床症状,减轻病痛,显著地延长生存期 [4~6] 。为了进一步探索N-CWS抗癌的免疫机制,采用现代药理实验方法观察N-CWS对小鼠腹腔巨噬细胞(M)的吞噬功能和细胞毒效应。现将实验结果总结如下。

  1 材料

     1.1 样品 N-CWS,本所提供。

     1.2 动物 ICR清洁级小白鼠,18~22g,雌雄各半,福建医科大学动物实验中心。

     1.3 细胞株 肉瘤S 180 及EC腹水瘤,购自中国科学院上海药物所,福建医科所传代保种。

     1.4 菌株 白色念珠菌,本所提供。

     1.5 0.075%中性红 称75mg中性红(Neutral red,C 15 H 17 N 4 Cl,生物染色素,上海试剂三厂)溶于100ml生理氯化钠溶液中,高压灭菌。

     1.6 细胞裂解液 0.1μ乙酸:乙醇=1:1(V:V)。

     1.7 仪器 XDS-1倒置显微镜(重庆光学仪器厂),CO 2 培养箱(Cole Parmer),DG3022A酶联免疫检测仪(国营华东电子管厂)。

  2 方法
    
  2.1 对动物肿瘤生长的抑制试验 [7]  在无菌条件下,抽取生长7天的S 180 小鼠腹水调整成细胞2×10 7 /ml的悬液,以生理氯化钠溶液溶解配制成2mg/ml N-CWS液,将瘤细胞悬液与N-CWS等量混合,对照组则以等量生理氯化钠溶液取代N-CWS与瘤细胞悬液混合,取0.2ml接种至小鼠右腋皮下,第14天解剖,称瘤重,计算肿瘤抑制率并进行统计学分析。

     肿瘤抑制率=(对照组瘤重-治疗组瘤重)对照组瘤重 ×100%

     2.2 效应细胞悬液的制备 小鼠腹腔注射N-CWS10mg/kg,每5天1次,对照组腹腔注射等体积无菌生理氯化钠溶液,连续3次后的第4天处死动物,以无菌操作法分别采取试验组和对照组的小鼠腹腔渗出细胞液(peritoneal exudate cells,PEC),镜检细胞并计数,75%为巨噬细胞macrophage,M),以RPMI-1640液配成浓度为5×10 7 /ml、2×10 6 /ml等的PEC悬液,备用(1天内用完)。

     2.3 体内细胞毒试验-Winn Test 采用无菌操作法抽取腹水型EC小鼠瘤液,调整成细胞1×10 8 /ml的悬液,按效靶比=1:2将试验组和对照组的PEC悬液(5×10 7 /ml)分别与瘤悬液等量混合,取0.2ml接种至小鼠右腋皮下,第14天解剖,称瘤重。

     2.4 对小鼠腹腔M的吞噬活性测定

     2.4.1 小鼠腹腔M制备 在96孔培养板中每孔加入100μl细胞浓度为2×10 6 /ml的PEC悬液,置37℃,5%CO 2 培养箱培养4h,弃上清,用37℃预温的RPMI-1640液清洗培养板,弃除不贴壁细胞,余下为小鼠腹腔M。

     2.4.2 M吞噬活性的测定 于富含M的96孔培养板中加入0.075%中性红溶液,37℃,5%CO 2 培养箱培养1h。取出,甩弃中性红。用37℃预温的PBS清洗培养板,加入细胞裂解液150μl。静置过夜,于酶联免疫仪上测570nm的吸光度A 570 。

  2.5 体外对小鼠腹腔M的吞噬试验 于正常小鼠的富含M的96孔培养板中加入100μl不同浓度的N-CWS,培养24h后,轻柔地甩弃孔内培养基,加入0.075%中性红溶液,37℃,5%CO 2 培养箱培养1h。取出,甩弃中性红,清洗培养板,加入细胞裂解液150μl。静置过夜,于酶联免疫检测仪上测570nm的吸光度A 570 。

  3 结果
    
  3.1 对动物肿瘤生长的抑制作用 每只小鼠于右腋皮下接种N-CWS200μg和2×10 6 瘤细胞,第14天N-CWS对小鼠S 180 的抑瘤率为72.65%,结果表明其明显抑制小鼠肉瘤S 180 的生长(见表1)。
    
  表1 N-CWS对小鼠S 180 的抑瘤作用略

     3.2 细胞毒效应 考察效应细胞与靶细胞比值为1:2情况下腹腔细胞体内杀伤肿瘤细胞的功能,结果试验组的瘤重明显比对照组的轻,两者具有显著的差异。表明N-CWS活化的腹腔细胞对肿瘤细胞具有明显的杀伤作用(见表2)。
   
  表2 腹腔细胞体内抑瘤效应略

     3.3 对小鼠腹腔M的吞噬功能 利用M吞噬中性红的原理测定小鼠腹腔M的吞噬活性,结果表明N-CWS明显激活了小鼠腹腔细胞,使M的吞噬能力显著增强(见表3)。

     表3 N-CWS腹腔给药对M吞噬功能的影响 略

     3.4 体外对小鼠腹腔M的吞噬作用 检测浓度为12.5~200μg/ml的N-CWS体外对正常小鼠腹腔M的吞噬中性红的情况,结果表明N-CWS体外能促进M的吞噬作用,在一定浓度范围内呈量效关系(见表4)。

 表4 N-CWS体外对M吞噬功能的影响(略)

     4 讨论

     4.1 与N-CWS同类的BCG-CWS等免疫活性物质能使M活化,使其吞噬能力显著增强。活化的M可分泌多种细胞毒效应分子,其中包括淋巴因子、NO、TNF、IL-6等,对异常细胞产生细胞毒性,其杀伤作用具有广谱性,而对正常细胞无害。本实验亦证明了N-CWS明显地激活了小鼠腹腔M,显著提高了M的吞噬能力。提示N-CWS具有非特异性激活腹腔内免疫细胞的作用。

     4.2 通常被微生物及其提取物如细菌的细胞壁、脂多糖等激活的M均具有杀伤肿瘤细胞的能力。通过体内Winn中和试验发现,经N-CWS激活的小鼠腹腔M对肿瘤细胞的细胞毒效应明显增强。说明N-CWS具有明显的非特异刺激免疫功能的作用。

     4.3 晚期肿瘤病人大多伴有免疫功能紊乱,在手术切除肿瘤后,使用免疫增强剂有利于调整机体的免疫功能,提高机体抗肿瘤作用,减少肿瘤的复发。在肿瘤放疗和化疗以后,机体免疫功能受到明显损害,使用免疫增强剂可促进机体免疫功能的恢复。N-CWS主要就是通过增强机体的免疫功能以达到杀伤肿瘤细胞的目的,即其抗癌作用是经过宿主中介增强机体的非特异性免疫作用,而非直接杀伤肿瘤细胞。
     
  参考文献
    
 1 Yamamura Y,Ogura T,Hirao F,et al.Phase I sutdywith cell wall skele-ton of Nocardia rubra.Cancer Treat Rep,1981,65:707-709.

    2 Araki K,Kawano F,Matsuzaki H,et al.Chemoimmunotherapy for acute noniymphocytic leukemia with BCG-and/or Nocardia rubra cell wall skeleton(CWS)I clinical efficacy.Kumamoto Med J,1983,36(1):15-27.

    3 Ogura T,Namba N,Hirao F,et al.Association of macrophage activation with antitumor effect on rat syngeneic fibrosarcoma by Nocardia rubra cell wall skeleton.Cancer Research,1979,39(12):47-06-4712.

 4 肖征恭,陈君玉,王清波,等.红色诺卡氏菌03-PO-8的分类研究.福建医学院学报(增刊),1992,26:84.

    5 余受程.红色诺卡氏菌制备的细胞壁骨架(N-CWS)Ⅱ期临床试验.中国肿瘤临床(增刊),1995,22:254-257.

    6 勒国华,王敬萍,张红酶,等.胞必佳(N-CWS)治疗恶性胸水的临床观察.结核病与胸部肿瘤,1996,2(4):15-17.

    7 张均田.现代药理实验方法,北京:北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社,1998,839-840.    
  作者单位:350007福建省微生物研究所

作者: 张祝兰 黄颖桢 唐文力等 2005-7-7
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