鲎试验法检测自制大输液热原的应用

    随着医疗卫生事业的不断发展，对输液质量的要求不断提高。热原检查的方法也在不断地扩大，鲎法首先被美国药典收载，今年被我国定为部颁标准。
   
　　近年来，国内外普遍认为并已得到证明，用鲎试剂检测大输液热原，可以部分代替家兔试验法。本文就应用鲎试验法检测大输液中热原的原理及实验材料、操作要点和我们几年来实践体会报告如下。
    
　　1 原理
    
　　鲎试验法就是利用鲎的血细胞溶解物（鲎试剂）与微量内毒素起凝胶化反应，从而检出微量内毒素（0.1～1mg/ml）的一种生物体外检测的新技术。
   
　　变形细胞溶解物（Tachyples Ameboeytehysate）与内毒素的凝胶反应是一种酶催化反应，TAL含有凝固酶原（Proc-Lottingenzyme）和凝固蛋白原（CoaguLoger）。凝固酶原被微量的内毒素和Ca 2+ 激活，活化的凝固酶原催化，凝固蛋白原水解成多肽亚单元，亚单元由双硫链相互连接形成凝胶物。这种凝胶反应相当敏感又高度专一，其灵敏度为兔法的5～10倍为检测内毒素提供了快速、灵敏、简便的生化测试法。
    
　　2 材料与方法
    
　　我们医院是从1992年开始使用鲎试验法检测大输液热原的，4年来共开展8个品种702批次。

   　 2.1 实验材料 （1）试剂:福建省药检所鲎研室产品。（2）内毒素参考标准品（大肠杆菌0111PA内毒素）:福建省药检所鲎研室产品。（3）无热原生理盐水（2ml/支）:福建省药检所鲎研室产品。（4）家兔:本院饲养。（5）检测检品:均为本院自制大输液，逐批抽样检查。
   
　　检测所用之器材:恒温水浴锅、按无热原处理的试管、注射器等。
   
　　2.2 采用方法 试管凝胶法。

   　 2.3 操作要点 （1）试验在清洁区内进行，所用之试管、注射器等玻璃用品经清洁液浸泡处理，蒸馏水冲洗干净后，以250℃30min或180℃2h干热处理。（2）检品pH值须在4.0～7.5之间。（3）鲎试剂对大肠杆菌内毒素敏感度为0.1mg/ml所需凝胶反应，时间为37℃（±1℃）1h。（4）检品及空白对照管（阳性对照和阴性对照各1支），同时置于37℃（±1℃）恒温水浴箱保温1h，中途不可振摇。
   
　　2.4 结果判断 （1）阳性:呈固态凝胶，试管倒置180℃凝胶不变形、不脱落者为阳性反应。（2）阴性:无变化或混浊絮状、粘液状或虽呈凝胶状但不能保持完整者为阴性反应。

　　3 小结
    
　　3.1 为确保用药安全，我们采用鲎法与兔法结合的方法，以兔法为准，一般认为:鲎法检测为阴性者，就认为热原合格，可供临床使用，鲎法检测为阳性者用兔法进行复检，以兔法为依据，如兔法为阴性者可供临床应用。4年来，在用鲎法检测中共出现阳性反应5批，采用兔法做对照，其中阴性者4批，阳性者1批。
   
　　3.2 影响凝胶反应的因素 （1）反应温度低于37℃（±1℃）凝胶化时间被推迟，高于37℃时反应易被阻断。（2）被测溶液的pH值要求4.0～7.5，过高、过低都必须加以调正（可用0.1N HCl或0.1N NaOH加以调正）。（3）凝胶反应是一种酶的反应，凡能使蛋白质变性的物质都可引起抑制作用，出现假阴性。凡制剂中含有吐温-80、络合剂、枸橼酸钠、二硫基丙醇、生物碱等都会干扰此反应。
   
　　3.3 根据福建省药检所鲎研室经验介绍，应用鲎试验法检测A、C、D热原时，因A、C、D中的枸椽酸钠络合Ca 2+ ，使反应受到抑制。加入钙、镁离子缓冲剂能使抑制作用逆转（其原理需进一步探讨），缓冲剂为0.02CaCl 2 、MgCl 2 混合液分装于安瓶内、高压灭菌、应用时每100ml A、C、D中可加入此缓冲液2ml即可。
   
　　3.4 鲎法检热原具有一定的局限法，鲎凝胶反应是一个酶促反应，特异性高，反应对革兰阴性杆菌产生的内毒素作用，但由于热源的多源性复杂性，所以造成了它的局限性。
   
　　按部颁标准利用鲎试剂可检测5%、10%葡萄糖溶液，生理盐水和注射用水，我院现在主要生产的大输液为5%、10%葡萄糖，生理盐水和注射用水及A、C、D等几种。pH值都居于4.0～7.5之间，所有制剂不含有金属及沉淀蛋白质的有机物，都没有盐析反应条件，即不至于影响凝胶反应的形成，因此用鲎试剂的凝胶反应来检测输液的热原是比较理想的。
    
　　（注:参考文献主要参考福建省药所有关热原及鲎资料汇编第一、二集）    

　　作者单位:157011黑龙江省牡丹江市心血管病医院