Literature
首页合作平台在线期刊中华医药杂志2005年第5卷第6期论著

银耳孢子碱提多糖的提取、分离及其结构分析

来源:INTERNET
摘要:【摘要】目的对银耳孢子发酵物水难溶性多糖进行提取分离,并对其结构进行分析。方法银耳孢子发酵物用热水提取水溶性组分后,对其水难溶性组分采用不同浓度的氢氧化碱液梯度提取,DEAE-纤维素分离和纯化,纯化后的组分分别进行分子量测定,红外光谱分析,水解并乙酰化后进行气相色谱分析确定单糖组成及摩尔比。结果......

点击显示 收起

  【摘要】 目的  对银耳孢子发酵物水难溶性多糖进行提取分离,并对其结构进行分析。 方法  银耳孢子发酵物用热水提取水溶性组分后,对其水难溶性组分采用不同浓度的氢氧化碱液梯度提取,DEAE-纤维素分离和纯化,纯化后的组分分别进行分子量测定,红外光谱分析,水解并乙酰化后进行气相色谱分析确定单糖组成及摩尔比。 结果  从银耳孢子发酵物中分离得到四个多糖;TFFB-A、TFFB-B、TFFB-C、TFFB-D。气相色谱分析显示,TFFB-A单糖组成为:D-葡萄糖、D-木糖、D-甘露糖,它们的摩尔比为5:5:3;TFFB-B单糖组成为:D-葡萄糖、D-木糖、D-甘露糖,摩尔比为2:2.5:8;TFFB-C单糖组成为:D-葡萄糖、L-鼠李糖,摩尔比1:15;TFFB-D单糖组成为:D-葡萄糖、D-木糖、D-甘露糖、D-半乳糖,摩尔比为3:2.5:6:1。 结论  从银耳孢子发酵物中用碱液梯度提取得到的4个多糖均为中性杂多糖。

    
  Study on extraction isolation and structural analysis of polysaccharides with sodi-um hydroxide from Tremella fuciformis Berk fermentation product
     
  LIU Pei-xun,GAO Xiao-rong,XUWen-qing,et al.

  Institute of Radiology,the Chinese Academy of Medical Sci-ences and Peking Vnion Medical College,Tianjin300192,China
   
  【Abstract】 Objective To study the polysaccharides extracted from Tremella fuciformis Berk fermentation product with Sodium hydroxide and characterize their chemical structures.Methods The polysaccharides were extracted from Tremella fuciformis Berk fermentation proudct with gradient Sodium hydroxide(NaOH)after hot water extraction,then neutralized with acid,precipitated with EtOH,deproteinized by the Sevag method,purified on DEAE-32-cellulose column.Four homogeneous polysaccharides named TFFB-A,TFFB-B,TFFB-C,TFFB-D were obtained and their molecular weight and IR were measured.After they hydrolyzed and acetylized,the products were perfomed with GC analysis to determine the composition and mol rate of the monosackcharides.Results The four polysaccharides named TFFB-A,TFFB-B,TFFB-C,TFFB-D were obtained and their structures were investigated.TFFB-A is mainly composed of D-glucose,D-xylose,D-mannose,their ratio is5:5:3;TFFB-B is D-glucose,D-xylose,D-mannose,the ratio is2:2.5:8;TFFB-C is D-glucose,L-rhamnose,the ratio is1:15;TFFB-D is D-glucose,D-xylose,D-mannose,D-galactose and the ratio is3:2.5:6.1.Conclusion The four polysaccharides obtained from Tremella faciformis Berk fermentation product with gradient Sodium hydroxide(NaOH)are all neutral ho-mopolysaccharides.
   
  【Key words】 polysaccharide;tremella funciformis Berk;extract and isolation;structural analysis
      
  银耳(Tremella fuciformis Berk),是一种高等真菌,属于有隔担子菌亚纲银耳科。银耳子实体所含化学成分较为复杂,初步分析表明含蛋白质6.7%~10%、碳水化合物65%~71.2%、脂肪0.6%~12.8%、粗纤维2.4%~2.75%及无机盐和水等。目前已知银耳多糖的种类有酸性杂多糖、中性杂多糖、胞壁多糖、胞外多糖和酸性低聚糖5种。银耳孢子发酵物的成分与银耳子实体的成分有较大的区别,对银耳孢子发酵物水溶性组分的研究文献报道较多,但对银耳孢子发酵物的碱提取物尚未进行研究。本研究对银耳孢子发酵物热水提取水溶性组分后,水不溶性组分采用不同浓度的氢氧化钠碱液梯度提取,经过酸中和、乙醇沉淀、除蛋白,DEAE-纤维素分离和纯化,得到4个多糖组分,经鉴定为均一多糖,并对其分子量和单糖组成、光谱特性进行了研究 [1~4] 。
    
  1 仪器与试剂

    
  1.1 仪器 Shimadzu GC-9A气相色谱仪,Shimadzu LC-10A液相色谱仪,Shimadzu UV-300紫外-可见双波长分光光度计,Shimadzu电子天平(type EB-280M-22),MAGNA-560FT-IR(Nicolet公司),Beckman DU800Spectrophotometer,DYY-III2型稳压流电泳仪(北京六一仪器厂),DYY-Ⅲ31B型电泳槽(北京六一仪器厂)。
   
  1.2 试剂 DEAE-纤维素为Whatman进口分装,层析纸为Whatman产品,醋酸纤维素薄膜为浙江黄岩四青生化材料厂生产,其余试剂皆为国产分析纯试剂。

  2 方法
    
  2.1 工艺流程 银耳孢子发酵粉→热水煮提→冷却离心→沉淀加一定浓度NaOH液搅拌,离心→上清液→3V乙醇沉析→多糖沉淀→多糖粗品→蒸馏水加热溶解→冷却离心→上清液→Sevag法除蛋白→离心取上清液→减压浓缩→蒸馏水透析→透析袋内容液→3V乙醇沉析多糖→沉淀→真空干燥→精制多糖→离子交换层析(DEAE-32-Cellu-lose)→洗脱液→减压浓缩→3V乙醇沉析多糖→沉淀→银耳碱提取多糖→离子交换层析纯化(DEAE-32-Cellulose)→洗脱液→减压浓缩→3V乙醇沉析多糖→沉淀干燥→均一体银耳碱提取多糖。
   
  2.2 提取分离精制工艺 [5,6]
    
  2.2.1 水提取 取300g银耳孢子发酵粉(中国医学科学院生物扶研究所药厂提供),加入10倍量的水,煮提约4h。煮后放冷,将提取液离心(15min,4000r/min)。提取后的残渣加入约10倍的水,以相同的方法煮提2次并离心分离,收集沉淀。合并3次所得的上清液,浓缩至小体积后放置,另作它用。取少许沉淀,加入水搅拌溶解后离心(15min,4000r/min),用苯酚-硫酸法检测上清液反应阴性。将所得沉淀于50℃烘箱中烘干,粗多糖重量为188.8g。
   
  2.2.2 碱液提取 取140g粗多糖,加入0.5mol/L NaOH1000ml,搅拦提取6h,离心15min,沉淀以相同的方法再提取2次,合并3次所得的提取液,沉淀另置。将提取液减压浓缩至约原体积的1/3,以1mol/L的HCl中和至pH=7,中和液减压浓缩至小体积。浓缩后的中和液用流动水透析3天。透析后的溶液用3V85%乙醇沉析,离心15min。收集沉淀,得到0.5mol/L NaOH提取的碱溶性多糖(62g)。0.5mol/L NaOH提取后的粗多糖,继用1mol/L NaOH、2.5mol/L NaOH、5mol/L NaOH分别进行提取,得到1mol/L NaOH(48g)、2.5mol/L NaOH(33g)、5mol/L NaOH(10g)提取物。将0.5mol/L NaOH提取物用约700ml水搅拌溶解,加入175ml Sevag试剂(氯仿:正丁醇=4:1),机械搅拌0.5h,离心(15min,4000r/min)。反复用此法除蛋白,直至无蛋白质反应为止。将所得上清液减压浓缩至小体积,流动水透析3天,透析袋内溶液用3V85%乙醇沉析。抽滤,沉淀用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤,真空干燥,得0.5mol/L NaOH提取精制多糖,称重为4.470g。以相同的方法对上述1mol/L NaOH、2.5mol/L NaOH、5mol/L NaOH提取物除蛋白。除蛋白后的各提取物重量分别为3.908g、0.929g、0.399g。
   
  2.2.3 分离、纯化 (1)分离 [7~10] :取600mg0.5mol/L NaOH提取所得精制多糖加入10ml蒸馏水,使之充分溶解,抽滤,取滤液。将滤液加于已经预处理的DEAE-32-纤维素层析柱,用0.1M NaCl溶液洗脱,流速为0.5ml/min,每10ml为1个单位分部收集,苯酚-硫酸法检测。合并单一洗脱峰浓缩至小体积,以流动水透析。透析液加入3V85%乙醇沉析。抽滤,沉淀用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤,真空干燥,多糖重量为148mg。以相同的方法分别对1mol/L NaOH(348mg)、2.5mol/L NaOH(558mg)、5mol/L NaOH提取物(399mg)进行DEAE-32-纤维素柱层析,分别得到单一洗脱峰。1M,2.5M,5M提取物分别得多糖113mg,180mg,157mg。
   
  (2)纯化:用(1)相同的方法分别对0.5M、1M、2.5M、5M提取物所得多糖用DEAE-32-cellulose柱层析纯化,洗脱液为0.1MNaCl,苯酚-硫酸法检测。所得多糖纯品重量分别为TFFB-A112mg、TFFB-B82mg、TFFB-C98mg、TFFB-D121mg。
   
  2.4 纯度检查(醋酸纤维素薄膜电泳法) 取醋酸纤维素 薄膜(2cm×10cm),置于缓冲液中浸泡10min后取出,吸去 多余的水分,在薄膜中央点样,电压为240V,电泳约40min。电泳完毕后,取出薄膜,置于染色液中染色15min后脱色。结果TFFB-A、TFFB-B、TFFB-C、TFFB-D四个样品于薄膜负极方向均有一个斑点。

  2.5 单糖组成分析
   
  2.5.1 纸层析 分别取各个多糖纯品10mg溶于2ml2mol/L三氟乙酸中,封管,沸水中水解6h。冷却后点样于What-man No.1层析滤纸上,用乙酸乙酯-吡啶-水-冰醋酸(5:5:3:1)展开剂饱和后展开,展开后用苯胺-邻苯二甲酸显色,用相应的标准品做对照。结果如图1。
 
  图1 银耳碱提取多糖水解物纸层析结果(略)1D-葡萄糖 2D-半乳糖 3D-甘露糖4D-木糖  5TFFB-A  6TFFB-B7TFFB-C  8TFFB-D  9葡萄糖醛酸10D-阿拉伯糖 11鼠李糖 12D-果糖
   
  从图1中可以看出,TFFB-A单糖组成为:木糖、葡萄糖或甘露糖;TFFB-B单糖组成为:木糖、葡萄糖或甘露糖;TFFB-C单糖组成为:鼠李糖、葡萄糖或甘露糖;TFFB-D单糖组成为:木糖、葡萄糖或甘露糖或半乳糖。各糖的Rf值之比为:D-葡萄糖;D-半乳糖;D-甘露糖;D-木糖:葡萄糖醛酸:D-阿拉伯糖:L-鼠李糖:D-果糖=1:0.9:1:1.2:0.8:1:1.5:0.8。
   
  2.5.2 气相色谱分析 将2.5.1所得水解液在水浴上减压蒸干,并烘干,得水解物。将水解物加入10mg盐酸羟胺及1ml无水吡啶,温热溶解后置于90℃水浴中加热30min,冷至室温后,加入1ml无水乙酸酐,继续在此水浴上加热30min,乙酰化完成后,进行气相色谱分析,并用乙酰化后单糖标准品对比。色谱柱固定液为SE-52,色谱柱为石英毛细管柱,柱长30m;柱温在180℃维持5min后每分钟升高3℃,在250℃维持10min;检测器为FID;进样室温度为270℃;载气为N 2 ,流速为50ml/min。
   
  2.6 多糖分子量测定 [11]  将各个多糖纯品进行高效凝胶柱色谱(HPGPC)分析,测定分子量。色谱柱为TSK G4000PWXL(6×300mm);检测器为Shadex;柱温为35℃;进样量为20μl;流动相为0.7%Na 2 SO 4 ,流速为0.5ml/min。
   
  2.7 多糖的红外光谱测定 将各个多糖纯品进行傅立叶转换红外光谱测定。仪器分辨率为4cm,扫描次数为20次。
   
  2.8 多糖的紫外光谱测定 将多糖溶于水,配成0.2mg/ml的溶液,进行紫外扫描,波长为200~800nm。

  3 结果
    
  3.1 本文从银耳孢子发酵物中用碱液提取的方法得到4个多糖组分,分别命名为TFFB-A、TFFB-B、TFFB-C、TFFB-D。经鉴定为均一体多糖。且都为中性多糖,不含糖醛酸。
   
  3.2 通过水解、乙酰化进行气相色谱分析,鉴定了这4个多糖的单糖组成。TFFB-A单糖组成为:D-葡萄糖、D-木糖、D-甘露糖,它们的摩尔比为5:5:3;TFFB-B单糖组成为:D-葡萄糖、D-木糖、D-甘露糖,它们的摩尔比为2:2.5:8;TFFB-C单糖组成为:D-葡萄糖、L-鼠李糖,摩尔比为1:15;TFFB-D单糖组成为:D-葡萄糖、D-木糖、D-甘露糖、D-半乳糖,摩尔比为3:2.5:6:1。
   
  3.3 用高效凝胶柱色谱法测定了这4个多糖的分子量。结果显示,TFFB-A、TFFB-B、TFFB-C、TFFB-D重均分子量分别为6.3×10 4 、6.4×10 4 、5.9×10 4 、5.1×10 4 。
   
  3.4 红外光谱扫描结果显示,4个多糖在3400cm的宽峰为0~H和N~H的伸缩振动,2930cm为C~H的吸收峰,两峰是糖类的特征吸收峰;在1022cm和1150cm附近处都有吸收,说明它们都是吡喃糖;在850cm附近处都有吸收,说明多糖结构中存在着α型糖苷键(即α端基差向异构体)。

  3.5 紫外扫描结果显示在260nm和280nm处没有吸收,说明不含蛋白质和核酸。
    
  4 讨论

    
  从银耳中提取水溶性多糖,国内外均有报道。本文从银耳孢子发酵物中用碱液提取得到4个均一体多糖,均为中性多糖,未见有文献报道,从现有数据看可以认为是新的杂多糖。
   
  在对多糖进行水解时,我们进行了预实验,采用了三氟乙酸和硫酸水解的方法,结果显示,硫酸水解后用碳酸钡中和的过程中,产生的大量硫酸钡沉淀会吸附水解产生的单糖,影响纸层析结果。采用三氟乙酸水解,剩余的三氟乙酸可减压蒸干,不会产生沉淀,因此最后采用三氟乙酸水解法。
   
  多糖分子量多数文献采用凝胶柱层析的方法进行测定,但这种方法误差较大。本文采用高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)测定多糖的分子量,具有快速、高分辨和重现性好的特点。上述多糖样品曾用醋酸纤维素薄膜电泳法进行纯度鉴定,显示单一斑点,但是在HPGPC图谱中仍然可以明显看到其间含有小分子杂质,这表明HPGPC法在比其它方法更准确。
   
  单糖的组成分析中,纸层析结果定性较为简便,但是灵敏度较差,本试验中由于葡萄糖与甘露糖的Rf值非常接近,因此难以单凭纸层析判断各个样品的单糖组成,在对多糖水解物进行了乙酰化后进行气相色谱分析才能最终判断多糖的单糖组成。 

  【参考文献】
    
  1 杨世海,尹春海,缪双红.银耳多糖及其药理作用的研究进展.中草药,1993,2(4):153-157.
   
  2 周爱如,吴彦坤,候元怡.银耳多糖抗肿瘤作用的研究.北京医科大学学报,1987,19(3):150.
   
  3 夏尔宁,陈琼华.银耳子实体多糖的分离、分析及生物活性,真菌学报,1988,7(3):166-174.
   
  4 高其品,张大军.银耳多糖及其抗肿瘤活性的研究(1).天然产物研究与开发,1991,3(3):43-48.
   
  5 Yoshiaki SONE,Akira MISAKI.Purification and characterization ofβ-D-Mannosidase andβ-N-Acetyl-D-Hexosaminidase of Tremella fuciformis.J.Biochem,1978,83,1135-1144.
   
  6 于嘉屏,许绍辉,张国治.DEAE纤维素柱层析法分离β-N-乙酰氨基已糖苷酶同工酶.第二军医大学学报,1990,11(4):350-352.
   
  7 董群,郑丽伊,方积年.改良的苯酚-硫酸法测定多糖和寡糖含量的研究.中国药学杂志,1996,31(9):550-553.
   
  8 司世麟,赵春桂,薛晓梅,等.苯酚-硫酸法色定糖法的应用.生物化学与生物物理进展,1986,5:68-70.
   
  9 Shigeo Ukai,Kazuo Hirose,Tadashiiho,et al.Polyaccharides in Fungi.I.Purification and characterization of acidic heteroglycans from aqueous extract of Tremella fuciformis Berk.Chem Pharm Bull,1974,22(5):1102-1107.
   
  10 Shigeo Ukai Kazuo Hirose,Tadashi Kiho,et al.Polysaccharides in Fun-gi.II.Structure analysis of acidic heteroglycans from Tremella fuci-formis.Berk.Chem Pharm Bull,1977,25(2):338-344.
   
  11 魏远安,方积年.高效凝胶渗透色谱法测定多糖纯度及分子量.药学学报,1989,24(7)532-536.
    
  作者单位:300192天津,中国协和医科大学中国医学科学院放射医学研究所 

作者: 刘培勋 高小荣 徐文清 2005-7-7
医学百科App—中西医基础知识学习工具
  • 相关内容
  • 近期更新
  • 热文榜
  • 医学百科App—健康测试工具