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1.2 砷化物对肿瘤细胞的毒性作用 研究发现As 2 O 3 具有治疗全反式维甲酸(ATRA)敏感和全反式维甲酸抗性的急性早幼粒细胞性白血病(APL)。不同剂量的As 2 O 3 、雄黄可诱导不同的APL细胞(NB 4 ,HL-60,MP-2,K562等)凋亡 [10~13] ,此结果在APL病人和APL动物模型均得到验证。砷剂对APL细胞的凋亡作用,为APL提供了新的治疗方法。砷剂还可以治疗其它恶性血液病(如骨髓瘤等) [14] ,而且对多种实体瘤细胞(如肝癌细胞、肺癌细胞、神经母细胞瘤、结肠癌细胞等)有杀伤作用 [15~19] 。
As 2 O 3 诱导凋亡的作用,并非对所有肿瘤细胞都敏感,其促凋亡效应与细胞的反应性氧化物(又称活性氧,Reac-tive oxygen species,ROS)水平有关。高飞等 [20] 研究发现对As 2 O 3 敏感的食管癌EC1.71细胞的固有ROS水平明显高于对As 2 O 3 不敏感的食管癌EC1867细胞的固有ROS水平,对As 2 O 3 敏感的白血病NB 4 细胞的固有ROS水平也明显高于对As 2 O 3 不敏感的白血病U937细胞的固有ROS水平。
2 砷化物细胞毒性的分子机制研究进展
2.1 致脂质过氧化 脂质过氧化(LP)与中毒、肿瘤、炎症反应等多种病理过程的发生、发展密切相关。研究表明,砷及其甲基化代谢产物均可诱发脂质过氧化反应 [21] 。近年来认为ROS可能参与砷化物诱导的致癌机制。Matsui等 [22] 检测砷相关皮肤癌组织中能敏感反映因氧化作用而引起DNA损伤的标记物8-羟基-2-脱氧鸟苷(8-hy-droxy-2-deoxyguanosine,8-OHdG),结果显示在28例砷相关皮肤肿瘤和砷角化病组织中的8-OHdG阳性率达78%,非砷相关的Bowen's病组织中仅9%,提示ROS参与砷致癌机制。Goering等 [23] 在体外培养的细胞中发现谷胱甘肽超氧化酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)和过氧化氢酶等抗氧化作用的酶能减弱或消除砷诱导的微核形成,而加入这些酶的抑制剂则可协同或增强砷的毒性作用。有学者认为全血GSH-Px可作为一项血液生化指标,用于慢性砷中毒的早期诊断和防治效果的评价 [24] 。还有研究表明 [25] ,若肿瘤细胞内的谷胱甘肽(GSH,可使细胞内巯基含量增高,保护细胞内重要蛋白的巯基不被砷剂结合)含量低于40nmol/mg蛋白,则对As 2 O 3 敏感;若高于40nmol/mg,则不能诱导其凋亡。故认为胞内GSH含量可作为预测砷剂敏感性的指标。
2.2 致DNA损伤 DNA的甲基化是机体维持基因稳定,阻止致癌损伤基因的保护性机制之一,砷在体内的甲基化有可能干扰正常细胞DNA的甲基化途径,继而引起癌原对DNA的损伤。Zhou等 [26] 报道无机砷可诱导培养细胞的DNA处于低甲基化状态,继而导致基因的异常表达。应用对甲基化敏感的随意引物扩增检测经亚砷酸盐诱导的人肺细胞和三种肾细胞系的基因组DNA的甲基化片断,与对照组比较,共有8个甲基化DNA序列有差异(6个过度甲基化,2个低甲基化),同时DNA甲基转化酶的活性和mRNA 表达都增加,表明砷可导致细胞DNA的甲基化处于失衡状态。
砷化物是否直接损伤DNA,目前尚未有定论。两方面都有实验证据支持,如李达圣等 [27] 应用单细胞电泳(Single cell gel electrophoresis,SCGE)比较砷(As 2 O 3 )对人类细胞DNA的损伤,表明细胞DNA损伤与砷处理量间呈显著的剂量反应关系和时效关系。受试细胞对砷的基因毒性的敏感强弱顺序为:PMA-HL60>DM SO-HL60>HL60>淋巴细胞。另一方面,有研究报道在体外实验条件下,iAs Ⅲ 和iAs Ⅴ 不能直接抑制人类细胞的DNA连接酶L1和L3(DNA修复的关键酶) [28] 。故有学者认为砷化物诱导细胞的遗传物质改变,如染色体畸变、姊妹染色体交换以及微核的形成不是由于砷化物对DNA分子的直接损伤,而是砷化物干扰细胞内某个或某些环节所致。在用砷化物处理中国仓鼠卵细胞和成纤维母细胞时发现细胞内有钙积聚现象,进一步将钙螯合剂EGTA或quin-2加入培养液中能抑制砷化物诱导微核形成,提示砷化物诱导微核形成与钙离子失衡有关 [29]。在DNA修复过程中,含有巯基的多聚ADP-核糖多聚酶(poly ADP-ribose polymerase,PARP)是真核细胞对DNA断裂的修复酶类之一。有报道体外实验发现亚砷酸钠可与PARP结合并抑制其活性,表明砷可通过与DNA修复蛋白的结合,干扰DNA的修复而致DNA损伤 [30] 。
孟紫强 [31] 的研究表明,砷对人血淋巴细胞转化及DNA合成具有双相性。即在低浓度下(亚砷酸钠1×10 -5 mol/L以下,砷酸钠5×10 -5 mol/L以下)可促进淋巴细胞的转化及其自发的DNA合成;高浓度下(亚砷酸钠1×10 -5 mol/L以上,砷酸钠5×10 -5 mol/L以上)则表现为抑制作用。由此可见,砷对人体的生物学和毒理学作用相当复杂。
2.3 致基因突变和改变基因表达 目前已有不少研究表明,砷可致基因突变,包括基因断裂、移码突变和点突变等。对台湾乌脚病流行区的砷相关的皮肤癌(基底细胞癌、鳞状细胞癌等)患者的肿瘤组织的p53基因进行检测发现,p53的变异率为28%~55.4%,变异多在外显子5和8处,多为错义变异 [32] 。孟紫强等 [33] 用亚砷酸钠处理CHO-AS52细胞,发现在高浓度下砷对gpt基因(黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶的编码基因)有较弱的致突变作用(移码突变)。
Germolec等 [34] 通过体外研究发现砷化物不但能增强原癌基因c-myc、c-fos的转录和表达,而且能诱导角质细胞来源的生长因子如TNF-α、GM-CSF等的过度转录和表达。另有报道砷酸钠能诱导鼠角质细胞(HEL30)表达白细胞介素IL-1α,并有线粒体中的活性氧化物的参与。砷还可激活IL-1α合成所需的核转录因子NF-κB(Nuclear fac-tor kappa B)和活化蛋白因子AP1(Activator protein1) [35] 。姚华等 [36] 研究亚砷酸钠对20个基因(包括生长激素基因、上皮生长因子基因、肝细胞生长因子基因、乳酸脱氢酶基因、神经生长因子受体基因、热休克蛋白70基因、CAAT结合转录因子基因、血管内皮生长因子基因、p53抑癌基因、c-myc癌基因等)表达水平的影响,表明砷可抑制CAAT结合转录因子基因的表达,使基因转录起始受阻,从而导致上述大部分基因表达水平下降。姚华等 [37] 还利用基因芯片技术研究了亚砷酸钠对免疫功能相关基因表达的影响,结果显示砷可通过抑制细胞角蛋白8基因(CK8)和人类白细胞抗原A基因(HLA-A)的表达来影响机体的免疫功能。Trouba等 [38] 分别从细胞生长的正反馈调节和负反馈调节机制研究亚砷酸钠对大鼠成纤维细胞生长的影响,结果表明长期染砷细胞中的原癌基因c-myc和E2F-1表达增高,而抑癌基因p27和促分裂原活化蛋白(MAP)磷酸激酶的表达降低。Ronald等 [39] 研究表明低剂量的砷(0.3~3.3μmol/L)会选择性地破坏大鼠肝癌染砷细胞内的肾上腺皮质激素受体(GR)对其细胞内的目标基因(磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶基因)表达的调节能力,提示砷可能是一种新的干扰内分泌的毒物,即使在非急性中毒的剂量下,也会改变受体的某些功能。
2.4 诱导细胞凋亡 总结目前对砷剂诱导肿瘤细胞凋亡机制的研究,砷剂抗肿瘤的分子机制主要包括:促使PML-RARα融合蛋白降解,调节凋亡调控基因和(或)蛋白的表达,巯基是砷剂诱导细胞凋亡的重要化学感受器,砷剂诱导细胞凋亡的通路主要包括半胱氨酸蛋白酶家族依赖性凋亡通路和线粒体依赖性凋亡通路。
2.4.1 促使PML-RARα融合蛋白降解 APL的特异性细胞遗传标志是染色体t(15;17)易位,导致PML基因和维甲酸(RA)受体α(RARα)基因融合,PML-RARα融合蛋白是APL发病的主要分子基础 [40,41] 。钟璐等[42] 研究表明,在不同诱导剂(ATRA、雄黄)刺激下,PML基因在蛋白水平参与细胞终末分化和诱导白血病细胞凋亡机制,PML蛋白发挥诱导凋亡细胞控制细胞生长的作用。研究发现,As 2 O 3 作用于NB 4 、MR-2细胞时,0.1μmol/L As 2 O 3 即足以降解PML-RARα蛋白,蛋白的降解早于细胞凋亡 [43,44] 。朱军等 [45] 研究证实As 2 O 3 的攻击点是以PML的氨基终端顺序为目标降解PML-RARα,而不同于RA是以RARα为目标。
2.4.2 调节凋亡调控基因和(或)蛋白的表达 虽然有多种基因参与细胞凋亡调控,但Bcl-2基因是细胞凋亡调控的最后共同通路之一。As 2 O 3 能降低NB 4 、NOP-1、NKH-1、LyH 7 细胞中Bcl-2的表达,从mRNA到蛋白质水平均有下调作用,且只有Bcl-2/Bax比例下降(这点比Bcl-2单独下调更重要),促使细胞凋亡 [46]。BCR-ABL融合蛋白是慢性粒细胞白血病(Chronic myeloid leukemia,CML)发病的分子基础。As 2 O 3 可降低酪氨酸蛋白激酶(protein tyrosine ki-nase,PTK)活性,阻断BCR-ABL融合蛋白的抗凋亡信号转导,从而诱导K562细胞凋亡 [47] 。
2.4.3 巯基是砷诱导细胞凋亡的重要化学感受器 巯基(-SH)是细胞重要的功能基团,砷剂易与巯基结合并使之氧化,从而启动细胞凋亡信号的产生。伍钢等 [48] 的研究表明,As 2 O 3 诱导神经母细胞瘤细胞SJ-N-SH调亡过程中,细胞内GSH(GSH中富含-SH)含量明显下降,处理72h后达最低点,且这种变化出现在细胞凋亡高峰(Bcl-2大量表达)发生之前。日益增加的研究结果表明,巯基的氧化或交联是诱导细胞凋亡重要的化学基团,含有二巯基基团的蛋白质可能是As 2 O 3 作用的主要靶分子,故巯基被认为是As 2 O 3 诱导细胞凋亡的重要化学感受器(chemosensor) [49] 。这与2.1中所述的GSH可作为预测细胞对砷剂的敏感性的指标是一致的。
2.4.4 半胱氨酸蛋白酶家族(Caspases)依赖性凋亡通路和线粒体依赖性 凋亡通路有配体或受体激活的Caspases依赖性凋亡通路是化疗药物诱导细胞凋亡的主要核心通路之一。研究发现砷剂诱导B-细胞白血病细胞株KOCl 44 和 LyH 7 细胞凋亡与Caspases活化有关。在1.0μmol/L As 2 O 3 诱导NB4细胞凋亡时,Capases-3被激活和降解PARP[聚(腺苷二磷酸-核糖)多聚酶],同时Bcl-2下调。在2.0μmol/L As 2 O 3 诱导恶性淋巴瘤细胞凋亡时,同样可见Capases-3被激活 [50] 。Capases酶抑制剂Z-VAD.frnk可阻断As 2 O 3 诱导的细胞凋亡。说明在砷剂诱导的细胞凋亡中,Capases酶系的激活是必需的 [49] 。线粒体依赖性凋亡通路是抗癌药物诱导细胞凋亡的另一核心通路。通过改变线粒体的跨膜电位等,导致细胞色素c(cytochrome-c,Cyt-c)释放,并与ATP,凋亡蛋白酶激活因子(apoptotic protease acti-vation factor-1,Apaf-1)联合作用,依次激活Caspases-9和-3、PARP等,从而导致细胞凋亡 [51] 。李艳芬等 [52] 的研究表明,As 2 O 3 对喉癌细胞株KB及其耐药细胞株KBv200均有较强的细胞毒性作用,检测到As 2 O 3 作用12h后,线粒体跨膜电位稍有下降,至24h、48h后出现跨膜电位显著下降,提示线粒体跨膜电位变化在As 2 O 3 诱导细胞凋亡中起着重要作用。贾培敏等 [53] 的研究显示,0.1~0.5μmol/L As 2 O 3 即抑制多发性骨髓瘤RPMI8226和U266细胞系生长,2.0μmol/L As 2 O 3 诱导两株细胞凋亡,并伴随线粒体跨膜电位下降和Caspase3的激活,提示线粒体是As 2 O 3 诱导细胞凋亡的重要且共同的靶子。
3 结语
综上所述,砷一方面对正常细胞组织有毒性作用,被认为是一种环境毒物和人类致癌物质;另一方面,砷对多种肿瘤细胞有杀伤或抑制其生长的作用,研究表明砷可诱导肿瘤细胞凋亡。许多研究已深入到基因、分子水平,但砷对生物体尤其是基因的作用相当复杂,不同的研究对象和研究方法,得到的结论不尽一致。到目前为止,不论是砷的致癌机制还是诱导肿瘤细胞凋亡机制尚未完全清楚。所以全面、深入研究砷的细胞毒性分子机制对砷中毒的防治、砷剂的临床应用等均有重大意义。
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* 基金项目:广东省自然科学基金资助项目(No.010270)
作者单位:510405广东广州,广州中医药大学临床药理研究所