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Department of Chemistry of Weifang Medical College，Weifang261042，China
【Abstract】 Objective To prepare chitosan-phospholipid complex and identify it.Methods Complexes in vari-ous rations were prepared by solvent dispersion and whet in wet separately and identify by electrophoresis.Results The complexes prepared by both the methods are soluble in thin acetic acid and the dispersion obtained is stable.Con-clusion Both methods used are suitable to prepare chitosan-phospholipid complex.
【Key words】 chitosan-phospholipid complex;electrophoresis;preparation
老年性痴呆即阿尔茨海默病（Alzheimer's Disease，AD）是一种多发于老年群体，以近期记忆障碍为主要临床症状的原发性脑退行性病变，是老年群体致残的严重疾病之一。其病因假说主要有胆碱能假说、铝中毒假说、基因突变假说等。广为接受的是胆碱能假说，它认为痴呆患者胆碱能神经损伤是导致认知功能障碍的最主要原因 ［1，2］ ，乙酰胆碱递质的减少在病变中起重要作用，氧自由基在致老年性痴呆中起重要作用，已有研究表明抗氧化疗法有望缓解疾病进展、阻止神经细胞丢失 ［3，4］ 。
证明壳聚糖具有显著抑制自由基生成的作用 ［5，6］ ，壳聚糖或甲壳质通过抑制巨噬细胞激活来阻止NO及OH自由基的生成。磷脂是细胞膜的重要组成成分，是合成神经递质-乙酰胆碱的前体物质，机体接受卵磷脂后生成胆碱，与乙酰基结合后生成乙酰胆碱，能直接为大脑所用。
将磷脂与天然活性成分在一定条件下进行复合而形成的磷脂复合物，可改变天然活性成分的理化性质和生物特性，增强其亲脂性。据此，将具有抑制自由基生成作用的壳聚糖与大豆磷脂以一定比例制成壳聚糖磷脂复合物，以便实验观察该复合物对大鼠痴呆记忆、认知功能及其对神经系统损伤的影响。现将壳聚糖磷脂复合物的制备报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料 大豆磷脂（上海浦东磷脂厂），壳聚糖（美国拜欧制药公司），乙醇、乙酸、丙酮等均为国产分析纯。DY-1电泳仪（上海医用分析仪器厂），420型电热恒温培养箱。显微镜（日本，OLYMPUS）。
1.2 药物制备
1.2.1 壳聚糖的提纯 将所购壳聚糖溶入浓度为1%的乙酸溶液中，加入浓度为1.0mol/L的氢氧化钠，调节pH至近中性，静置，收集中间部分沉淀，抽滤，依次用蒸馏水、乙醇、丙酮洗涤，抽滤后60℃干燥，研磨成粉末，置干燥器中备用。
1.2.2 溶剂分散法制备壳聚糖磷脂复合物 称取2份1.0g壳聚糖制成浓度0.5%的乙酸（1%）溶液，加热至90℃。分别称取5.0g和1.0g磷脂溶入热的乙醇中，趁热加入到壳聚糖溶液中，搅拌，保温30min。挥尽溶剂后分成两部分，一部分保存做进一步试验，另一部分真空干燥后，所得固体物研细备用。
1.2.3 湿态研磨法制备壳聚糖磷脂复合物 称取30.0g大豆磷脂入研钵中，加入10ml1%乙酸溶液，充分润湿，加入30.0g提纯后的壳聚糖，混匀，逐渐加入预热至65℃的1%乙酸溶液240.0ml，充分研磨均匀，得胶状复合物。
1.2.4 壳聚糖复合物的鉴定
1.2.4.1 壳聚糖的电泳 将浓度为0.5%壳聚糖乙酸溶液2.0ml加入到U形管中，上面缓慢加入2.0cm高度的1%乙酸溶液，插入铂电极，调节电压120V，电泳5min。
1.2.4.2 大豆磷脂的电泳 用45%的乙醇溶解适量大豆磷脂，在U形管中先加入3.0ml的1%乙酸溶液，然后从两侧分别缓慢加入磷脂溶液至液层厚度1.0cm。插入电极到乙酸溶液层，调节电压至120V，电泳5min。
1.2.4.3 复合物的电泳 取壳聚糖磷脂复合物溶液2.0ml加入U形管中，上面小心加入2.0cm高的1%乙酸溶液，插入铂电极，调节电压120V，电泳5min。
1.2.5 复合物的稳定性考察 两种方法制备的复合物经稀醋酸溶液溶解后得半透明状液体，无肉眼可见颗粒。分别将液体分成两部分，密封，一部分室温放置，另一部分冰箱内4℃放置。间隔10天分别用肉眼和显微镜观察一次。
1.2.6 复合物的溶解性能 将所制备的复合物分别用水、稀乙酸进行溶解试验，评价其溶解性。
2 结果
2.1 壳聚糖磷脂复合物的电泳鉴定结果 壳聚糖溶液电泳5min后壳聚糖明显向负极移动，并在电极上析出固体。由于壳聚糖本身带正电荷，故电泳时向与它自身所带电性相反的负性电极移动;大豆磷脂向正极移动。因为磷脂在溶液中本身电离，带负电荷，故向正极移动;壳聚糖磷脂复合物整体向负极移动，即使电压升高到300V也没有向正极移动的成分分离出来。原因是壳聚糖与磷脂复合后，卵磷脂的负电性不足以中和壳聚糖的正电性，使复合物整体带正电荷，故电泳时向负极移动，没有出现分离现象，说明复合物在此电压条件下相当稳定，不会分解。
2.2 稳定性考察结果 壳聚糖磷脂复合物稳定性考察结果见表1。
2.3 复合物的溶解性 两种方法所制的复合物均能溶解于稀乙酸中形成半透明溶液，且壳聚糖与磷脂的质量比为1:1时最易溶解，质量比1:5（壳聚糖:磷脂的电荷比为1:1）的复合物也很易溶解，但随着磷脂比例的增加溶解性逐渐降低。
表1 壳聚糖磷脂复合物稳定性考察结果（略）
当使用蒸馏水进行溶解试验时，发现两种复合物的溶解性均比在稀乙酸中要差，但比单纯的磷脂要好。新制备的质量比小于1:5的干燥复合物可缓慢溶入水形成半透明溶液。两种方法制备的复合物均可完全溶解于0.5%的乙酸溶液中，形成稳定的溶液。
3 讨论
复合物是由两种或两种以上的化合物以静电引力、氢键、盐键、疏水键等非共价键结合形成的复合体，没有确定的分子量，其颗粒大小一般在胶体范围，有的可称其为纳米粒。通过复合作用可以改变其中的化合物的物理性质，如溶解性等，由于制备方法简单，成本低廉，近年来在药物制剂方面应用逐渐增多。其鉴定一般可采用紫外、红外、核磁甚至X衍射等方面的数据改变来判断复合物的形成。但对一般没有明确晶体形成的复合物来说，由于纯度、组成比例、粒子大小等都是可变因素，并不像化合物那样有唯一的分子组成和确定的结构，对非晶体结构的复合物进行波谱分析意义不大。本研究针对所制备复合物的电性特点，首次采用电泳方法明确了复合物的形成，方法简单易行。试验中还对电泳的条件进行了试验，发现工作电压应以80～120V为宜，电压过高易在负极产生气体，干扰观察，过低则使复合物迁移速度过慢，不能快速完成。
经过对不同比例的复合物进行的溶解性试验发现，复合物中磷脂的比例增加对复合物的溶解性产生负面影响，壳聚糖与磷脂的质量比超过1:5的干燥复合物难溶于水，而小于此比例的复合物可顺利溶解。主要原因是比例增大使脂溶性磷脂含量增加，降低了复合物的极性而致。
试验采用的两种制备方法均可得到壳聚糖磷脂复合物，都具有良好的溶解性能。采用溶剂分散法制备的复合物溶解后的体系更加稳定。但是研磨法的操作更加简便，节约能源，适合于大量制备。
【参考文献】
1 Gottfeis CG.Alzheimer's disease and senile dementia:biochemical characteristics and aspects of treatment.Psychopharmacology，1985，86:245.
2 朱兴族.神经退行性疾病病变机理及药物作用新靶点.中国药理学会通讯，2000，17（2）:5-7.
3 Rao AV，Balachandran B.Role of oxidative stress and antioxidants in neurodegenerative diseases.Nutr Neurosci，2002，5（5）:291-309.
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5 Xie W，Xu P，Liu Q.Antioxidant activity of water-soluble chitosan derivatives.Bioorg Med Chem Lett，2001，11（13）:1699-1701.
6 Hwang SM，Chen CY，Chen SS，et al.Chitinous materials inhibit nitric oxide production by activated RAW264.7macrophages.Biochem Bio-phys Res Commun，2000，271（1）:229-233.
* 基金项目:山东省卫生厅资助项目，NO.1999CATCCBT
作者单位:261042山东潍坊，潍坊医学院化学教研室（△ 生理学教研室）
261042山东维坊，潍坊医学院附属医院